Desenvolvimento de diferentes ensaios utilizando a técnica "Loop-mediated isothermal amplification" e avaliação de acurácia para o diagnóstico da leishmaniose cutânea

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Soares, Arthur Ribeiro Cheloni
• Orientador(a): Avelar, Daniel Moreita de
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Fiocruz/IRR
• Link de acesso: https://arca.fiocruz.br/handle/icict/66173
• topic: Leishmaniose cutânea; Diagnóstico; LAMP; doença negligenciada; HSP70; kDNA; Cutaneous leishmaniasis; diagnosis; LAMP; neglected tropical disease; HSP70; kDNA; Leishmaniose cutânea/diagnóstico; LAM; Doença Negligenciada/diagnóstico

As técnicas recomendadas pelo Ministério da Saúde/Brasil para o diagnóstico da leishmaniose cutânea (LC) apresentam limitações de acurácia, tempo de execução e complexidade laboratorial. Há uma demanda crescente por testes de fácil execução e alto desempenho para o diagnóstico de doenças negligenciadas. O desenvolvimento desses testes visa a possibilidade de implantação em serviços básicos de saúde, favorecendo um diagnóstico rápido e preciso, o que contribui para o tratamento dos pacientes. Entre as técnicas com possível aplicação no diagnóstico da LC destacam-se os testes moleculares baseados no método "loop-mediated isothermal amplification – LAMP". O principal objetivo foi desenvolver e avaliar novos testes de LAMP para o diagnóstico de LC no Brasil. Este estudo compreendeu duas etapas consecutivas, sendo que na primeira etapa foi realizada a padronização e estabelecido os valores de limite de detecção, especificidade analítica e reprodutibilidade da interpretação visual. Na segunda etapa, a acurácia diagnóstica dos diferentes ensaios de LAMP foi avaliada em painel de amostras de biópsia, com 60 casos e 40 controles de LC. Foram padronizados três testes de LAMP utilizando os alvos moleculares Hsp70, kDNA e 18S. O limite de detecção para os ensaios LAMP-Leish/Hsp70, LAMP-Leish/kDNA e LAMP-Leish/18S foi, respectivamente, de 100 fg, 1 pg e 100 pg. Na avaliação de especificidade analítica, LAMP-Leish/Hsp70 amplificou somente DNA do gênero Leishmania, enquanto LAMP-Leish/kDNA não foi capaz de reconhecer todas as espécies de Leishmania avaliadas. Os primers do conjunto LAMP-Leish/18S amplificaram DNA de Trypanosoma cruzi e Sporothrix schenckii, o que inviabilizou sua inclusão na análise de validação com amostras de painel. O teste LAMP-Leish/Hsp70 apresentou sensibilidade superior (86,7%) usando a PCR kDNA como referência, comparado a 42% do LAMP-Leish/kDNA (p<0,0001). Ambos os testes apresentaram 100% de especificidade. A acurácia do teste LAMP-Leish/Hsp70 foi de 92% (IC 95%: 84,9-96,5), contra 65% (IC 95%: 54,8-74,3) do teste LAMP-Leish/kDNA. Foi obtida uma concordância perfeita (k = 1) em relação à reprodutibilidade da interpretação visual dos resultados em ambos os ensaios. Não houve diferença significativa na taxa de positividade dos testes em relação ao tempo de evolução da lesão. Na análise de taxa de positividade considerando a carga parasitária, o teste LAMP-Leish/Hsp70 não apresentou diferença significativa (p = 0,54), enquanto que o teste LAMP-Leish/kDNA demonstrou uma taxa de positividade de 64,7% em amostras com alta carga parasitária e 32,6% em amostras com baixa carga (p = 0,02). O teste LAMP-Leish/Hsp70 apresentou resultados analíticos e de desempenho clínico satisfatórios. Os resultados encontrados representam a possibilidade de ampliar a disponibilidade de um método diagnóstico rápido, simples e confiável para LC, com potencial de uso em laboratórios de unidades básicas de saúde.