Padronização de PCR em Tempo Real para detecção de carbapenemases dos tipos KPC e NDM produzidas por bactérias Gram negativas

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Ribeiro, Sthefanie da Silva
• Orientador(a): Asensi, Marise Dutra
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://arca.fiocruz.br/handle/icict/35695
• topic: PCR em Tempo Real; Carbapenemases; Bactérias Gram-negativas; Carbapenemases; Real Time PCR; Gram-negative Bacteria; Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real; Carbapenêmicos; Bactérias Gram-Negativas; Métodos de Análise; Controle de Qualidade; Vigilância Sanitária

Infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) constituem um grave problema de saúde pública, tanto em países desenvolvidos, quanto naqueles em desenvolvimento. A vigilância sanitária possui papel fundamental para o controle e contenção da disseminação de patógenos carreadores de genes de resistência no ambiente hospitalar e na comunidade. O mecanismo mais importante associado à resistência aos ß-lactâmicos é a produção de β-lactamases que hidrolisam sua estrutura química causando a perda de função deste antimicrobiano. Os carbapenêmicos são a principal opção para o tratamento de infecções por bactérias Gram-negativas multiresistentes. Recentemente a resistência mediada por carbapenemases tem crescido, sendo observada no Brasil e ao redor do mundo. As carbapenemases mais descritas no Brasil são as serina cabapenemases KPC e OXA-48 em enterobactérias, OXA-23 em A. baumannii e as Metalo-beta-lactamases NDM, SPM. Objetivo: Padronizar uma metodologia para detecção de carbapenemases blakpc e blandm em bacilos Gram-negativos através de PCR em Tempo Real. Metodologia: Os ensaios de padronização foram realizados no ABI PRISM Prism7500 (Applied Biosystems) com cepas controle previamente identificadas por testes fenotípicos e PCR convencional como produtoras de KPC, NDM e não-produtoras. O controle endógeno utilizado foi o gene constitutivo 16SrRNA. A padronização seguiu cinco pontos principais: 1) Metodologia de extração, através de sonicação, lise térmica e lise de colônia diretamente durante a reação de PCR. 2) Definição da metodologia de ciclagem. 3) Otimização da reação com diferentes concentrações de sondas e iniciadores. 4) Comparação entre MasterMix NAT e IBMP. 4) Bioequivalência de sondas e iniciadores de diferentes fabricantes. 5) Análise da especificidade e sensibilidade do protótipo frente a 100 cepas previamente caracterizadas. 6) determinação do Limite de detecção do protótipo Resultados: As metodologias de extração testadas se mostraram igualmente eficazes com amplificação de blakpc e blandm, entretanto a lise térmica da colônia realizada durante a ativação enzimática da enzima Taq hot start possuía maior relação custo benefício, sendo mais rápida que as demais. O protocolo de ciclagem do CDC se mostrou tão eficaz quanto o estabelecido por Bio-Manguinhos, sendo o do CDC mais rápido. Os ensaios de otimização revelaram que as melhores concentrações de sondas e iniciadores testadas foram (0,2µM e 0,4µM respectivamente) com valores médios de Ct de 17,43 para KPC e 20,53 para NDM. Mesmo após a otimização realizada com o Master Mix IBMP e adição de ROX, este não apresentou resultados tão expressivos quando comparados com o MIX NAT. Quanto a Bioequivalência os melhores resultados foram encontrados com Sondas da marca BIOSEARCH e iniciadores da marca IDT. O protótipo padronizado possuiu 100% de especificidade para a detecção de KPC e NDM e 100% de sensibilidade. Mesmo após a diluição seriada por 10 vezes, o protótipo foi capaz de detectar a presença dos genes alvos em concentrações mínimas de DNA. A partir desta primeira etapa para a validação do protótipo foi possível determinar sua eficácia frente a um grande número de cepas, sendo necessária a análise de outros parâmetros para a validação total do protótipo.