Desenvolvimento e validação do ensaio de PCR digital em gotículas (Droplet Digital Polymerase Chain Reaction) para o diagnóstico da esquistossomose intestinal

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Almeida, Matheus Alves de
• Orientador(a): Oliveira, Edward José de
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://arca.fiocruz.br/handle/icict/74572
• topic: Schistosoma mansoni; Esquistossomose intestinal; Eiagnóstico laboratorial; ddPCR; Schistosoma mansoni; Intestinal schistosomiasis; Laboratory diagnosis; ddPCR; Schistosoma mansoni/patogenicidade; Esquistossomose mansoni/diagnóstico; Técnicas de Laboratório Clínico/métodos; Reação em Cadeia da Polimerase/métodos

No Brasil, a esquistossomose intestinal é causada por Schistosoma mansoni e o diagnóstico laboratorial para busca ativa de casos da doença é feito pela técnica de Kato-Katz (KK). No entanto, essa técnica apresenta limitações de sensibilidade, quando aplicada em indivíduos com baixa carga parasitária, fato que compromete a estimativa da real prevalência da doença, contribuindo para a manutenção da transmissão. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi desenvolver e validar o ensaio de PCR digital em gotas (ddPCR) para o diagnóstico da esquistossomose intestinal. Para tanto, foi extraído o DNA total de vermes adultos e de 177 amostras de fezes de indivíduos residentes no município de Conde (BA, Brasil), área de alta endemicidade para a doença, utilizando-se os conjuntos de reagentes DNeasy Blood & Tissue Kit e QIAamp® Power Fecal Pro DNA® Kit, ambos da Qiagen Gmbh. O ensaio ddPCR foi padronizado utilizando iniciadores e sonda descritos por Siqueira et al., 2021, que amplifica uma sequência de 90 pb da região Sm1-7 do genoma de S. mansoni (GenBank: M61098). As melhores condições laboratoriais foram definidas com base em ensaios pilotos utilizando diferentes temperaturas de complementaridade (55 a 62°C), concentrações de iniciadores (700, 800 e 900 nM), sonda (150, 200 e 250 nM), quantidade total de DNA (10, 20, 40 e 60 ng), reagentes e equipamentos Bio-Rad Laboratories. A repetibilidade (cinco amostras repetidas seis vezes em um ensaio) e a reprodutibilidade (seis amostras repetidas em quatro ensaios) foram avaliadas. A sensibilidade e especificidade analíticas foram analisadas usando DNA do parasito e utilizando amostras negativas para S. mansoni e positivas para outros parasitos, respectivamente. A sensibilidade, especificidade, razão de verossimilhança, acurácia e a concordância dos resultados foram calculados tendo o “teste referência”, composto pelos resultados do KK e Helmintex (HTX), como critério de definição de casos e não casos da doença. Os resultados do ddPCR foram comparados aos do KK e HTX e aos da Amplificação Isotérmica Mediada por Alças (LAMP) e do PCR em tempo real (qPCR). As condições ótimas foram definidas como: temperatura de complementaridade de 56,5° C, concentração de iniciadores de 700 nM, sonda de 150 nM e quantidade total de DNA de 40 ng. O ensaio apresentou sensibilidade analítica de 0,1 pg de DNA, repetibilidade com coeficientes de variação (CV) entre 6,8% e 11,1% e reprodutibilidade com CV entre 5,4% e 20,34%. Baseado no ponto de 12,73 cópias/μL, definido pela análise da curva ROC, a taxa de positividade do ddPCR foi de 51,98%, semelhante à encontrada pelo “teste referência” (51,41%; p= 0,84), superior à do qPCR (21,47%; p<0,05) e menor que a apresentada pelo LAMP (55,37%; p=0,45). O ensaio apresentou sensibilidade de 86,81% (IC: 81,16%-92,47%), especificidade de 86,11% (IC: 78,94%-90,83%), RV+ 5,74 (IC: 2,46–13,39), RV- 0,16 (IC: 0,07–0,36) e acurácia de 85,88% (IC: 80,08%-91,67%). O ddPCR apresentou maior concordância com o teste referência (Kappa: 0,72; IC: 0,66-0,77) do que com o LAMP (Kappa: 0,27; IC: 0,20-0,35) e qPCR (Kappa: 0,40; IC: 0,34-0,47). A análise econômica apresentou um valor de U$9.42 por amostra ensaiada no ddPCR. É importante destacar que este foi o primeiro estudo feito para aplicação do ddPCR para o diagnóstico da esquistossomose intestinal, causada por S. mansoni. Os resultados obtidos foram promissores e novos estudos devem ser realizados para avaliar o desempenho do ddPCR no diagnóstico da esquistossomose intestinal em indivíduos residentes em áreas de baixa e moderada endemicidade.