Lipases microbianas: prospecção, produção e aplicação.

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: MARTINS, P. A.
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Lípase; Enzima; Fermentação; Solido; Aspergillus; Burkholderia gladioli; Omega-3 fatty acids; Immobilized enzymes; Solid state fermentation
• Link de acesso: http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/1137006

Resumo: Este trabalho teve como objetivo a produção de lipases por fermentação em estado sólido com microrganismos isolados de dendezeiro (Elaeis guineenses Jacq.). Após prospecção dos microrganismos isolados, destacaram-se pela alta atividade lipolítica o fungo filamentoso Aspergillus sp. (BDA-FI-7) e a bactéria Burkholderia gladioli BRM58833. Os parâmetros para o cultivo por fermentação em estado sólido foram otimizados, sendo as maiores atividades lipolíticas obtidas de 68,5 ± 5,4 e 1096,7 ± 39,3 U.gss-1 (unidades de atividade lipolítica por grama de sólido seco) para o fungo e a bactéria, respectivamente, quando avaliadas pela hidrólise de palmitato de p-nitrofenila. Quando utilizada trioleína como substrato, as maiores atividade lipolíticas encontradas foram de 7,7 ± 0,7 e 374,2 ± 20,4 U.gss-1 para o fungo e a bactéria, respectivamente. Como as atividades obtidas para a lipase bacteriana foram mais promissoras que as do fungo, o restante do estudo foi focado na lipase bacteriana. A análise proteômica do extrato produzido pela bactéria revelou que, para as condições otimizadas de cultivo, são secretadas duas esterases e três lipases verdadeiras. Quando purificada, a lipase BGL mostrou preferência por substratos de cadeia longa sendo a maior atividade lipolítica observada a 50 °C e pH 9. Além disso, a lipase foi resistente a solventes e exibiu uma termoestabilidade expressiva quando comparada a outras lipases, revelando o potencial desta enzima em reações de hidrólise e síntese de ésteres. A síntese de biodiesel foi estudada com o uso dos sólidos fermentados obtidos do cultivo da bactéria. Os maiores teores de ésteres etílicos foram de 67,3 ± 1,7 e 74,7 ± 3,8% em 120 h para as reações em óleo de soja refinado e óleo de palma bruto, respectivamente. Adicionalmente, BGL foi imobilizada e estabilizada por diferentes técnicas e abordagens, resultando em derivados 263,8 e 70,1 vezes mais estáveis à inativação a 60 °C e pH 10, respectivamente. Resultados preliminares na hidrólise de óleo de peixe demonstraram o potencial da técnica de revestimento com polímeros bifuncionais para obtenção de um derivado estável e com maior capacidade catalítica para produção de PUFAs ômega-3, atingindo uma atividade de hidrólise de 0,207 ± 0,002 U.mg-1 . Por fim, BGL foi clonada em Escherichia coli encontrando- se uma atividade lipolítica extracelular de 71,3 ± 1,8 U.mg-1 para as melhores condições de cultivo. Abstract: The goal of this work was to produce lipases by solid state fermentation with microorganisms isolated from the oil palm tree (Elaeis guineenses Jacq.). After evaluation of the isolated microorganisms, the filamentous fungus Aspergillus sp. (BDA-FI-7) and the bacterium Burkholderia gladioli BRM58833 stood out for their high lipolytic activity. The parameters for cultivation by solid state fermentation were optimized, obtaining lipolytic activities of 68.5 ± 5.4 and 1096.7 ± 39.3 U.gds-1 (units of lipolytic activity per gram of dry solid ) for the fungus and bacterium, respectively, when evaluated by the hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate. When using triolein as substrate, lipolytic activities were 7.7 ± 0.7 and 374.2 ± 20.4 U.gds-1 for the fungus and bacterium, respectively. As the activities obtained for the bacterial lipase were more promising than those for the fungus, the rest of the study was focused on the bacterial lipase. Proteomic analysis of the extract produced by the bacterium revealed that, for optimized culture conditions, two esterases and three true lipases are secreted. When purified, BGL lipase preferred long-chain substrates with the highest lipolytic activity observed at 50 °C and pH 9. In addition, BGL was resistant to solvents and exhibited an expressive thermostability when compared to other lipases, revealing the potential of this enzyme in reactions of hydrolysis and synthesis of esters. The synthesis of biodiesel was studied with use of the fermented solids obtained from the cultivation of the bacterium. The highest levels of ethyl esters were 67.3 ± 1.7 and 74.7 ± 3.8% in 120 h for the reactions in refined soybean oil and crude palm oil, respectively. Additionally, BGL was immobilized and stabilized by different techniques and approaches, resulting in derivatives 263.8 and 70.1 times more stable to inactivation at 60 °C and pH 10, respectively. Preliminary results in the hydrolysis of fish oil demonstrated the potential of the coating with bifunctional polymers to obtain a stable derivative with greater catalytic properties for the production of omega-3 PUFAs, reaching an hydrolysis activity of 0.207 ± 0.002 U.mg-1 . Finally, BGL was cloned in Escherichia coli with an extracellular lipolytic activity of 71.3 ± 1.8 U.mg-1 for the best culture conditions.