Avaliação da migração e neurodiferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) de pacientes com displasia cortical

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Marinowic, Daniel Rodrigo
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul; Faculdade de Medicina; Brasil; PUCRS; Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde
• Palavras-chave em Português: DISPLASIA CORTICAL; EPILEPSIA; CÉLULAS-TRONCO; FIBROBLASTOS; NEUROCIÊNCIA; MEDICINA; CIENCIAS DA SAUDE::MEDICINA
• Link de acesso: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/6778

As alterações do desenvolvimento do córtex cerebral apresentam-se como um grupo de malformações com uma distinção e patogênse ainda não bem definidas. A displasia cortical focal (DCF) é uma das formas mais frequentes de malformações do desenvolvimento cortical, sendo a patologia subjacente a uma parcela significativa de epilepsias parciais refratárias ao tratamento medicamentoso. A displasia cortical focal engloba múltiplos tipos de alterações tanto na arquitetura cortical quanto em anormalidades citológicas. Palmini e colaboradores classificaram as displasias corticais focais de acordo com observações na substância branca e na arquitetura da camada cortical. Os mecanismos envolvidos na gênese da DCF são pouco investigados, principalmente pelo número limitado de casos e a falta de modelos experimentais adequados e suas causas provavelmente estão relacionadas a mutações somáticas. A falta de modelos pré-clínicos preditivos que possam ser utilizados no estudo da fisiopatologia e o histórico enfraquecido quando se trata em traduzir a descoberta terapêutica de modelos animais para o uso humano, fortalece a necessidade de estudar o desenvolvimento cerebral a partir de células originadas do próprio paciente. A geração de células iPSC e diferenciação tecidual específica de células de pacientes acometidos por doenças neurológicas relevantes possui um valor inestimável para a realização de testes além de fornecerem uma capacidade adicional e única para estudar o desenvolvimento inicial e a progressão das patologias associadas ao SNC. O objetivo do presente trabalho é estabelecer um modelo celular de Displasia Cortical Focal através da geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) a partir de fibroblastos de pacientes afetados. Fibroblastos humanos foram obtidos de biópsias de pele de dois pacientes com DCF e foram cultivados até a quinta passagem. Foi realizada análise imunopatológica e das vias de sinalização AKT/mTOR no tecido cerebral displásico. Células iPSC foram geradas a partir dos fibroblastos através da exposição a vetores virais contendo os genes OCT4, KLF4, SOX2, e C-MYC e caracterizadas por imunohistoquímica. Foi realizado ensaio de migração celular dos fibroblastos (24h, 48h e 72h) e das iPSC (3 dias e 7 dias). As células iPSC foram neurodiferenciadas e analisadas nos períodos de 14 dias, 22 dias e 35 dias. Nesses períodos, foram realizadas análises morfológicas, imunohistoquímica (polarização) e moleculares (genes relacionados a via PI3K/ATK/mTOR). Ambos os pacientes foram diagnosticados com DCF tipo IIb. O paciente 01 apresentou valores maiores que o paciente 02 em relação à área marcada das vias AKT e mTOR, tanto na via fosforilada como não fosforilada no tecido cerebral, com diferenças estatisticamente significativas. Clones iPSC dos pacientes e controles foram gerados e caracterizados a partir dos fibroblastos de pele. Tanto as iPSC dos pacientes quanto do controle apresentaram morfologia e polarização semelhante a células nervosas após protocolo de neurodiferenciação. No ensaio de migração celular, fibroblastos com DCF migraram com mais intensidade em 24 horas (p<0,0001) e 48 horas (p<0,001). As células iPSC não apresentaram diferença no potencial de migração celular nos períodos analisados. Durante o protocolo de neurodiferenciação, as células iPSC dos pacientes com DCF apresentaram valores menores de expressão dos genes 4EBP-1, β-Catenina, CIAP-1, CIAP-2 e PI3K, e valores mais elevados da expressão de MCL 1. Alterações na migração celular no tecido adulto e em processos como de proliferação celular acentuada, deficiência de proteína de adesão celular, alteração na expressão de genes responsáveis pelo controle de apoptose e alteração na via PI3K responsável no sistema nervoso central pela sobrevivência celular, controle de apoptose, migração neuronal, desenvolvimento morfológico dos neurônios e formação das neurotransmissões, puderam ser evidenciadas nas células dos pacientes com DCF em relação aos pacientes controle e podem estar relacionadas com a formação do cérebro com displasia.