Caracteriza??o biof?sico-qu?mica da enzima Orotato Fosforibosiltransferase (OPRT, EC 2.4.2.10) de Mycobacterium tuberculosis H37Rv : modelo para o desenvolvimento de novas drogas anti-tuberculose

• Ano de defesa: 2011
• Autor(a) principal: Andrade, Ardala Elisa Breda
• Orientador(a): Santos, Di?genes Santiago
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Pontif?cia Universidade Cat?lica do Rio Grande do Sul
• Programa de Pós-Graduação: Programa de P?s-Gradua??o em Biologia Celular e Molecular
• Departamento: Faculdade de Bioci?ncias
• País: BR
• Palavras-chave em Português: BIOLOGIA MOLECULAR; BIOLOGIA CELULAR; TUBERCULOSE; NUCLEOT?DEOS; ENZIMAS
• Área do conhecimento CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
• Link de acesso: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/5397

A tuberculose ? uma doen?a infecciosa cr?nica, causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, e requer novas iniciativas urgentes para o seu tratamento e cura em decorr?ncia do surgimento de cepas resistentes a drogas, sua abrang?ncia global, e o significativo aumento de pessoas infectadas entre pacientes imunodeprimidos; al?m do grande n?mero de pessoas infectadas com a forma latente da tuberculose, que atuam como reservat?rio da doen?a. As enzimas que constituem as vias de metabolismo de nucleot?deos s?o alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da tuberculose, tanto na sua forma ativa quanto latente. A enzima orotato fosforibosiltransferase (OPRT), pertencente ? via de s?ntese de novo de nucleot?deos de pirimidina, catalisa a transfer?ncia revers?vel do grupamento fosforibosil da mol?cula de 5 -fosfo-?-Dribose 1 -difosfato (PRPP) para o ?cido or?tico (OA), formando orotidina 5 - monofosfato (OMP), mol?cula precursora dos demais nucleot?deo de pirimidina. Este trabalho descreve a clonagem, amplifica??o e caracteriza??o do produto do gene pyrE de M. tuberculosis H37Rv como uma enzima OPRT funcional; a determina??o de suas constantes cin?ticas aparentes e verdadeiras para as rea??es direta e inversa; ensaio de inibi??o pelos produtos; e a determina??o do mecanismo cin?tico da rea??o como sendo Mono-Iso Ordenado Bi Bi, mecanismo que at? ent?o n?o havia sido descrito para uma enzima pertencente ? fam?lia das fosforibosiltransferases do tipo I. As constantes termodin?micas e o perfil de discrimina??o termodin?mica permitiram a identifica??o dos modos de intera??o dos substratos naturais da enzima com seu s?tio de liga??o. A caracteriza??o da rea??o catalisada pela enzima OPRT micobacteriana ? uma etapa essencial para o desenvolvimento de novas drogas de a??o espec?fica que permitam o melhor controle da tuberculose. Os dados resultantes da caracteriza??o da enzima foram utilizados como ponto de partida para o planejamento, sele??o e teste de inibidores seletivos contra a OPRT de M. tuberculosis. Um composto inicial, com valores de na faixa de concentra??o de nanomolar, foi identificado como potencial composto l?der, sendo submetido a diferentes protocolos de derivatiza?ao qu?mica, permitindo a obten??o de uma mol?cula derivada com valores de constantes inibit?rias e perfil de discrimina??o termodin?mica aprimorados. Estes dois compostos foram caracterizados como inibidores competitivos e incompetitivos em rela??o aos substratos naturais da OPRT, OA e PRPP, respectivamente; onde o conhecimento do singular mecanismo cin?tico de rea??o da enzima de M. tuberculosis foi utilizado para o planejamento de mol?culas capazes de formar um complexo tern?rio n?o catal?tico ( ? ? ), inibindo a s?ntese de nucleot?deos de pirimidina e sequestrando mol?culas de PRPP do meio celular, afetando ainda, outros processos metab?licos essenciais. Os resultados deste trabalho colaboram ainda para uma melhor compreens?o do metabolismo de nucleot?deos de micobact?rias e fornecem informa??es relevantes para o avan?o do desenvolvimento de inibidores de a??o seletiva sobre alvos moleculares espec?ficos para o tratamento e profilaxia da tuberculose