Produção heteróloga do peptídeo antimicrobiano Cp- Tionina II em Physcomitrium patens

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Leal, Lara Nascimento
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Católica de Brasília; Escola de Saúde e Medicina; Brasil; UCB; Programa Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia
• Palavras-chave em Português: Expressão heteróloga; Peptídeos antimicrobianos; Physcomitrium patens; CRISPR/Cas9; Heterologous expression; Antimicrobial peptides; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
• Link de acesso: https://bdtd.ucb.br:8443/jspui/handle/tede/3697

Com o crescente surgimento de cepas microbianas resistentes aos fármacos antimicrobianos a saúde mundial enfrenta uma crise contra patógenos que já não respondem a tratamentos convencionais como respondiam. Nesse âmbito, peptídeos antimicrobianos (PAMs) se destacam e pesquisas com foco nessas moléculas aumentam a cada dia. Entretanto estas moléculas não são produzidas em grande quantidade nos organismos de origem. Para obtenção em grande quantidade de peptídeos podemos contar com várias estratégias que vão desde o isolamento da molécula direto do organismo que a produz, passando pela síntese química e a expressão via sistema heterólogo. Nesse trabalho foi realizada a produção heteróloga do peptídeo antimicrobiano Cp- Tionina II no musgo Physcomitrium patens através do sistema CRISPR/ Cas9 usando três vetores de transformação pActCas9, pBNRf e pLand_cpt. Após transformação foram obtidos 4 clones transformados que após confirmação por sequenciamento, foram submetidos a análise de expressão via qRT-PCR onde o clone 1.4.2 foi selecionado para sua produção em larga escala utilizando biorreator. Após cultivo de 45 dias em fotobiorreator, uma extração proteica do tecido vegetal foi feita e submetida a análises via MALDI-TOF bem como foi feito um ensaio de atividade antimicrobiana usando as cepas ATTC 25923 para Staphylococcus aureus e ATTC 25922 para Escherichia coli. O bioensaio não mostrou atividade devido a baixa presença da proteina recombinante no extrato Apesar de bem estabelecido como bioprodutor, na literatura não se encontra muitos relatos de P. patens expressando proteínas recombinantes menores 10kda, podendo assim não ser considerado o melhor sistema para expressão de peptídeos em níveis comerciais. Entretanto, levando em consideração a dificuldade geral de se expressar peptídeos em plantas, podemos concluir que o uso da técnica de CRISPR, foi essencial para que o peptídeo fosse expresso nesse sistema.