Proteína recombinante do vírus da artrite encefalite caprina com potencial antigênico

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Dantas, Tânia Valeska Medeiros
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual do Ceará
• Palavras-chave em Português: Antigenicidade; Caprinos; Ciências veterinárias; Clonagem; Lentivírus
• Link de acesso: https://siduece.uece.br/siduece/trabalhoAcademicoPublico.jsf?id=58499

Em primeiro lugar procede a um levantamento dos principais estudos sobre proteínas recombinantes e experimentos de vacinas contra o CAEV e outros lentivírus. Secundariamente visa a produzir uma proteína recombinante do vírus da artrite encefalite caprina com potencial antigênico para ser utilizado como antígeno em testes diagnósticos sorológicos em sistema de expressão bacteriana e em plasmídeo, No tocante ao primeiro objetivo, foi realizada uma revisão de literatura das pesquisas nos últimos dez anos (1998- 2008) referente às vacinas contra lentivírus animal. No que concerne à produção da proteína recombinante do CAEV, foi realizada uma análise do gene do CAEV para determinar qual a região do gene gag codificava para a p28 do vírus. A região considerada foi dos nucleotídeos 971-1606 do CAEV Cork. Os oligos foram desenhados desde o inicio e final da sequência (20 e 21pb). Foi realizada a ligação do gene da p28 do gag em plasmídeo pUC19 e depois uma subclonagem em pET32b. Realizaram-se o sequenciamento de ambas as construções e a purificação por cromatografia de afinidade. Procedeu-se à PCR de colônia e à extração de plasmídeos por lise alcalina. A melhor condição de expressão da proteína recombinante foi testada a 37ºC e temperatura ambiente, utilizando como indutor o isopropil β-D-1- thiogalactopiranosidase (IPTG) nas concentrações de 0,5, 1 e 3mM. Para verificar o resultado da expressão, as proteínas foram analisadas pela eletroforese em gel de poliacrilamida. Para avaliar o seu potencial antigênico, foi efetuado o western blot, utilizando como antígeno a proteína recombinante, e como anticorpo primário o soro de animal soropositivo. O sequenciamento confirmou a correta inserção do fragmento do gene da p28 nos dois plasmídeos, os quais apresentaram uma banda de 636 pb após a PCR na eletroforese em gel de agarose. A bactéria E. coli expressou a proteína em diversas condições. A 37ºC a bactéria expressou a proteína em menores intensidades e na concentração a 0,5 mM de IPTG, não houve expressão. A temperatura ambiente, em todas as concentrações, a proteína foi expressa, sendo que a 1 mM de IPTG apresentou maior intensidade. Com base nos resultados, considerou-se a melhor condição de expressão da proteína p28 recombinante em E.coli BL21 o tratamento de 1 mM de IPTG a temperatura ambiente. Ao analisar o potencial antigênico da proteína recombinante no western blot, essa reagiu com o soro positivo, apresentando forte banda característica de peso moleular 28 kDa. Conclui-se que houve a produção da proteína p28 do CAEV recombinante pela bactéria e essa apresenta um potencial antigênico que provavelmente poderá ser utilizado como antígeno em testes diagnósticos. Palavras-chaves: Lentivírus. Expressão de p28. Clonagem. Western Blot. Antigenicidade.