Aplicação biotecnológica : anticorpo monoclonal anti-desoxinivalenol para monitoramento e avaliação da exposição pelo consumo de trigo (Triticum aestivum L.)

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Joice Sifuentes dos Santos
• Orientador(a): Elisa Yoko Hirooka .
• Banca de defesa: Eliana Furlong, Ijoni Hilda Costabeber, Tereza Cristina Rocha Moreira de Oliveira, Carlos Kemmelmeier
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos.
• País: BR
• Link de acesso: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000151917

Fusarium spp., fitopatógeno relevante no campo, pode produzir micotoxinas de ocorrência inevitável em produtos de origem vegetal. F. graminearum contamina trigo e pode produzir desoxinivalenol (DON), tricotoceno de caráter citotóxico, emético e inibidor de síntese protéica, responsável por perdas na agricultura e produção animal. Analítica sem uso de solvente tóxico e sem equipamento sofisticado tem sido a meta de biotecnologia no controle de qualidade visando segurança alimentar. O trabalho teve como objetivo padronizar método imunológico para detecção de DON em trigo e derivados e avaliar a Ingestão Diária Estimada (IDE) desta toxina pela população de Londrina-PR. Para isso, AcM foi produzido por hibridoma linhagem DON.3 em meio RPMI + 10 % de soro fetal bovino (SFB), sendo o meio gradativamente substituído por Hybridoma-Serum Free Medium (HSFM), resultando em 2320 mL de sobrenadante de cultivo. Os sobrenadantes referentes aos meios contendo RPMI + 10 % SFB, 75 % e 100 % meio H-SFM (1690 mL) foram precipitados com sulfato de amônio a 40 % de saturação, dialisados contra PBS pH 7,3 seguido por água ultra-pura, obtendo-se 71,3 mg de AcM anti-DON semi-purificado para desenvolvimento de Enzyme linked immunossorbent assay ELISA competitivo indireto (ic-ELISA) e coluna de imunoafinidade (CIA). O ensaio ic-ELISA padronizado consistiu de sensibilização com 2 &#956;g/mL de DON-HG-BSA, anti-DON (1,25 mg/mL) diluído a 1:200 e anticorpo secundário (anti-IgGHRP) na diluição 1:2000, com limite de detecção 177,12 &#956;g/kg. A performance do ic-ELISA desenvolvido foi comparada com Cromatografia Líquida de Alta Eficiência-Arranjo de Fotodiodo (CLAE-PDA) e CLAE-Espectrometria de Massas (CLAEEM). A análise de 34 amostras de trigo dos Estados do Paraná e Rio Grande do Sul (safras 2006, 2007 e 2008) indicou a eficiência de ic-ELISA desenvolvido, com coeficiente de correlação com CLAEPDA de 0,84 para detecção de DON em grão de trigo. DON foi detectado em 24 amostras (70,6 %) por CLAE-PDA (ND a 1531,5 &#956;g/kg) e 17 (50,0 %) por ic-ELISA (ND a 1362,1 &#956;g/kg), sendo a relação ic-ELISA/CLAE-PDA de 0,68. A análise de 44 amostras por CLAE-EM apresentou correlação de 0,93 com ic-ELISA, com DON detectado em 22 amostras (50,0 %) por CLAE-EM (ND a 9906,9 &#956;g/kg) e 31 amostras (71,4 %) por ic-ELISA (ND a 12291,4 &#956;g/kg), relação ic-ELISA/CLAE-EM de 1,64. A recuperação de DON por ic-ELISA em amostras artificialmente contaminadas variou de 26,9 % (gérmen de trigo) a 108,4 % (grãos de trigo). Metodologia de extração e posterior análise por ic- ELISA foi satisfatória para as amostras de grãos de trigo (recuperação 108,43 %, desvio padrão relativo DPR 11,7 a 16,1 %) e farinha de trigo (103,0 %, DPR 19,0 a 36,2 %), não ocorrendo o mesmo para quibe e gérmen de trigo. Em suma, o monitoramento de DON por ic-ELISA em 136 amostras de grãos de trigo, obtidas de campos experimentais e de produtores tritícolas, pertencentes a safras de 2006, 2007 e 2008, revelou a presença da toxina em 67,6 %, média de 2140,19 &#956;g/kg (amostras positivas de 206,3 a 16076,5 &#956;g/kg). Oitenta amostras (58,8 %) apresentaram nível de contaminação de DON inferior ao limite máximo permitido pela Comunidade Européia em cereais para o consumo humano (< 1750 &#956;g/kg). Amostras oriundas do Paraná apresentaram contaminação inferior (845,8 &#956;g/kg) à observada no Rio Grande do Sul (3163,8 &#956;g/kg), sendo que também observou-se diferenças significativas entre as diferentes regiões dos Estados e, entre as três safras analisadas (p< 0,05). Referente a 44 amostras de trigo em diferentes fases de processamento em moinho (grão na recepção, trigo limpo, trigo úmido, farinha, gérmen e farelo de trigo), 16 (36,4 %) apresentaram-se positivas por ic-ELISA (ND a 4262,4 &#956;g/kg). Analisando 22 amostras de trigo para quibe coletadas em diferentes estabelecimentos comercias paranaenses por inspetores da Vigilânica Sanitária, DON foi detectado em 10 amostras (45,4 %, média de 166,1 &#956;g/kg, ic-ELISA). Para avaliar o consumo de derivados de trigo, foi utilizado um Questionário de Freqüência de Consumo de Alimentos (270 indivíduos, baseado em população de 447000 habitantes e erro amostral de 6 %). Macarrão e pão francês foram os derivados mais consumidos, observando-se correlação entre o consumo de derivados de trigo e dados sóciodemográficos e antropométricos. A IDE foi calculada considerando-se nível de DON em 76 amostras de grãos de trigo produzidas no Paraná e fator de processamento. A IDE de DON apreciando o consumo de pão francês e macarrão foi 0,82 &#956;g/kg peso corporal/dia, sendo que 85 indivíduos (32,7 iii%) ultrapassaram a Ingestão Diária Máxima Tolerável Provisória de 1 &#956;g/kg p.c./dia. A confecção de protótipos de CIA, utilizando AcM anti-DON produzido, não foi concluída com êxito, devendo-se prosseguir desde etapa de produção de AcM. A ocorrência de DON em trigo e IDE apontam para necessidade de medidas de controle da produção da toxina a nível de campo, já que os métodos de processamento atualmente utilizados não promovem diminuição e/ou detoxificação de DON. As expectativas futuras prometem a utilização deste AcM como ferramenta para desenvolvimento de imunossensores, contribuindo com avanço metodológico através da automação de controle de qualidade – segurança alimentar.