Caracterização molecular e proteômica de mecanismos de resistência à polimixina B em Klebsiella pneumoniae

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2021
Autor(a) principal: Queiroz, Paula Assis
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Universidade Estadual de Maringá
Departamento de Análises Clínicas e Biomedicina
Programa de Pós-Graduação em Biociências e Fisiopatologia
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Resistência bacteriana
Microbiologia
Proteômica
Biologia molecular
616.92
Ciências da Saúde
Farmácia
Link de acesso: http://repositorio.uem.br:8080/jspui/handle/1/7641
Resumo: Orientador: Prof.ª Dr.ª Vera Lucia Dias Siqueira
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spelling Caracterização molecular e proteômica de mecanismos de resistência à polimixina B em Klebsiella pneumoniaeResistência bacterianaMicrobiologiaProteômicaBiologia molecular616.92Ciências da SaúdeFarmáciaOrientador: Prof.ª Dr.ª Vera Lucia Dias SiqueiraTese (doutorado em Biociências e Fisiopatologia) - Universidade Estadual de Maringá, 2021RESUMO: O surgimento e a disseminação generalizada de micro-organismos multidroga resistentes (MDR) associada à resistência às polimixinas nos últimos anos tornam o tratamento de infecções por Klebsiella pneumoniae produtoras de carbapenemases tipo KPC (KPC-Kp) um desafio na prática clínica. Estudos moleculares e proteômicos nesta temática permanecem escassos, sendo o perfil proteômico uma importante ferramenta para o conhecimento dos mecanismos de resistência aos medicamentos. Desta forma, com o objetivo de fornecer informações relevantes sobre os mecanismos potencialmente associados à resistência às polimixinas, a indução de heterorresistência foi realizada em um isolado clínico (R-Kp/Clinical) e em uma cepa de referência ATCC® BAA-1705 ™ (R-Kp/ATCC) de KPC-2-Kp. A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas de alta definição (2D nanoUPLC-HDMSE) foi utilizada para a pesquisa de proteínas diferencialmente expressas entre as cepas heterorresistentes e seus correspondentes sensíveis à polimixina B. Quatro proteínas expressas diferencialmente (OmpA, SlyB, SucB, AcrA) e os principais genes associados à resistência à polimixina (pmrA, pmrB, pmrC, pmrD, pmrE, pmrK, phoQ e phoP) foram selecionados para realização de estudos de expressão gênica por PCR quantitativo (qPCR). Os resultados destes estudos foram compilados em dois manuscritos e apresentados no capítulo II. Duzentas e trinta e oito (238) proteínas foram identificadas e quantificadas, 126 nos isolados ATCC e 157 nos isolados clínicos. Nossos resultados mostraram que o perfil proteômico em KPC-Kp resistente à polimixina B envolveu vários processos biológicos e funções de proteínas, incluindo atividade transportadora transmembrana, oxidorredutases, atividade catalítica, resposta ao estresse, ligação de íons metálicos, metabolismo e outros. Destacamos que OmpA, um componente integral da membrana, foi regulado negativamente, enquanto a lipoproteína de membrana externa SlyB e a bomba de efluxo de múltiplas drogas AcrA foram reguladas positivamente nos isolados resistentes à polimixina B. Os genes sucB, phoQ, pmrB, pmrD e pmrE foram regulados positivamente apenas no isolado clínico resistente e os genes slyB, ompA e phoP foram regulados positivamente em ambos os isolados heterorresistentes (R-Kp/Clinical e R-Kp/ATCC). A proteína SlyB foi superregulada nos isolados resistentes e, semelhantemente, o gene slyB foi expresso diferencialmente em R-8 Kp/Clinical e R-Kp/ATCC em níveis mais elevados do que outros genes envolvidos na resistência à polimixina. Em conclusão, os efeitos cumulativos de proteínas e genes diferencialmente expressos podem contribuir para os diversos mecanismos de resistência às polimixinas. Nossos resultados destacam a participação do gene slyB, como um dos mecanismos regulatórios possivelmente envolvidos na heterorresistência à polimixina B em KPC-KPABSTRACT: Polymyxin resistance has increased gradually for the last few years, making KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae (KPC-Kp) infections' treatment a difficult task. Although studies on the mechanisms of polymyxin resistance are expanding, molecular and proteomic studies on this topic remain scarce, and proteomic profiling might play an important role in the development of drug resistance. Meanwhile, to provide insights about potential mechanisms associated with polymyxin B resistance, heteroresistance induction was performed in KPC-2-producing K. pneumoniae clinical isolate (R-Kp/Clinical) and ATCC® BAA-1705™ (R-Kp/ATCC). Two-dimensional reversed phase Nano Ultra Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry approach with multiplexed Nano Electrospray High Definition Mass Spectrometry (2D nanoUPLC-HDMSE) was used to search for diferentially expressed proteins between polymyxin B-susceptible KPC-Kp (ATCC® BAA 1705 and blood culture clinical isolate) and its paired heteroresistant-induced mutantes. Four differentially expressed proteins (OmpA, SlyB, SucB, AcrA) and the main genes associated with polymyxin resistance (pmrA, pmrB, pmrC, pmrD, pmrE, pmrK, phoQ and phoP) were selected to carry out gene expression studies by quantitative PCR (qPCR). Two hundred and thirty eight (238) proteins were identified and quantified, 126 in the reference strain (ATCC) and 157 in the clinical isolate. Our results showed that the proteomic profile in polymyxin B-resistant KPC-Kp involved several biological processes and protein functions, including transmembrane transporter activity, oxidoreductases, catalytic activity, stress response, metal ion bind, metabolism and others. We highlight that Omp A, an integral component of the membrane, was downregulated, while the outer membrane lipoprotein SlyB (conserved protein member of the PhoPQ regulon) and multidrug efflux pump AcrA were upregulated in polymyxin B-resistant KPC-Kp strains. Genes: sucB, phoQ, pmrB, pmrD and pmrE were upregulated in the resistant isolate R-Kp/Clinical and slyB, ompA and phoP genes were upregulated in both heterorresistant isolates (R-KP/Clinical and R-Kp/ATCC). SlyB protein and slyB gene were differentially expressed in R-Kp/Clinical at levels higher than the other genes known to be involved in polymyxin resistance. In conclusion, cumulative effects of exclusive expression proteins, overexpressed proteins, mapped pathways, and interactive proteins partner of the over expressed may 10 contributes to the polymyxins resistance. Our results highlight the participation of the slyB gene, as one of the regulatory mechanisms possibly involved in the determination of polymyxin B heteroresistance in KPC-2-producing K. pneumoniae74 f. : il. (algumas col.).Universidade Estadual de MaringáDepartamento de Análises Clínicas e BiomedicinaPrograma de Pós-Graduação em Biociências e FisiopatologiaCentro de Ciências da SaúdeSiqueira, Vera Lúcia DiasKobayashi, Renata Katsuko TakayamaCardoso, Rosilene FressattiCampanerut-Sá, Paula Aline ZanettiTognim, Maria Cristina BronharoQueiroz, Paula Assis2024-07-15T21:36:23Z2024-07-15T21:36:23Z2021info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfQUEIROZ, Paula Assis. Caracterização molecular e proteômica de mecanismos de resistência à polimixina B em Klebsiella pneumoniae. 2021. 74 f. Tese (doutorado em Biociências e Fisiopatologia) - Universidade Estadual de Maringá, 2021, Maringá, PR.http://repositorio.uem.br:8080/jspui/handle/1/7641info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da Universidade Estadual de Maringá (RI-UEM)instname:Universidade Estadual de Maringá (UEM)instacron:UEM2024-07-16T19:50:48Zoai:localhost:1/7641Repositório InstitucionalPUBhttp://repositorio.uem.br:8080/oai/requestrepositorio@uem.bropendoar:2024-07-16T19:50:48Repositório Institucional da Universidade Estadual de Maringá (RI-UEM) - Universidade Estadual de Maringá (UEM)false
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