Estudos Estruturais das Proteínas Metionil-tRNA Sintetase de Rickettsia typhi, HistidiltRNA Sintetase de Ehrlichia chaffeensis, Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase de Acinetobacter baumannii e Recombinase A de Herbaspirillum seropedicae

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Penteado, Renato Ferras
• Orientador(a): Iulek, Jorge
• Banca de defesa: Barbosa, João Alexandre Ribeiro Gonçalves , Huergo, Luciano Fernandes, Krieger, Nadia, Etto, Rafael Mazer
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual de Ponta Grossa
• Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação em Química
• Departamento: Departamento de Química
• País: Brasil
• Palavras-chave em Português: Metionil-tRNA Sintetase de Rickettsia typhi.; Histidil-tRNA Sintetase de Ehrlichia chaffeensis; Gliceraldeido-3-Fosfato Desidrogenase de Acinetobacter baumannii; Recombinase A de Herbaspirillum seropedicae; Methionyl-tRNA Synthetase from Rickettsia typhi; Histidyl-tRNA Synthetase from Ehrlichia chaffeensis; Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase from Acinetobacter baumannii; Recombinase A from Herbaspirillum seropedicae
• Área do conhecimento CNPq: CNPQ::CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::QUIMICA
• Link de acesso: http://tede2.uepg.br/jspui/handle/prefix/4280

A determinação de estruturas tridimensionais de proteínas de organismos patogênicos pode auxiliar no entendimento do funcionamento detalhado destas macromoléculas e evidenciar características que as diferenciam das presentes em organismos hospedeiros. O conhecimento adquirido desta maneira também pode ser utilizado como ponto de partida para estudos computacionais com vistas a auxiliar a interpretação das informações estruturais já existentes. Neste contexto, o desenvolvimento deste trabalho teve como objetivos determinar a estrutura tridimensional por Cristalografia de Difração de Raios X de três enzimas pertencentes a organismos patogênicos: Metionil-tRNA Sintetase de Rickettsia typhi (RtMetRS), Histidil-tRNA Sintetase de Ehrlichia chaffeensis (EhHisRS) e Gliceraldeído-3-fosfato Desidrogenase de Acinetobacter baumannii (AbGAPDH), e simular o complexo da Recombinase A do organismo não patogênico Herbaspirilum seropedicae (HsRecA) com substratos dsDNA, ATP e íons Mg2+ , nas suas composições nativa e mutante (L53Q), com a finalidade de entender a razão da perda de atividade da proteína mutante. RtMetRS e EhHisRS participam da biossíntese de proteínas e suas funções são prover ao tRNAMet (de iniciação e elongação) e ao tRNAHis os aminoácidos cognatos nos respectivos organismos. RtMetRS, membro da família MetRS1, teve sua estrutrura resolvida complexada à L-metionina no grupo de espaço P1 a uma resolução de 2,30 Å com oito monômeros na unidade assimétrica. Durante o processamento das imagens de difração e confirmação posterior com tentativas de refinamento, verificou-se que os dados indicavam geminação e demandaram a consideração das leis de geminação referentes a quatro domínios cristalinos geminados durante o refinamento estrutural no grupo de espaço de baixa simetria. Além disso, o uso de Simetria Não Cristalográfica (NCS) se mostrou importante pelo impacto positivo na qualidade dos índices de refinamento. A análise da estrutura mostrou que os monômeros apresentam razoável heterogeneidade conformacional entre eles. Obsevou-se que o domínio CP se encontra em uma conformação diferente daquela observada em complexo equivalente nas homólogas da família MetRS1. A caracterização de estabilidade térmica da RtMetRS nas formas apo e complexos com os substratos L-metionina ou ATP, através da técnica de nanofluorimetria diferencial de varredura (nanoDSF), mostrou que estes substratos não conferiram maior estabilidade significativa frente à desnaturação térmica em relação à forma apo. EhHisRS se mostrou razoavelmente insolúvel e não foi submetida a ensaios de cristalização. A avaliação da sua estabilidade térmica por nanoDSF nas formas apo e complexos com Lhistidina ou ATP revelou um ΔTm ≈ +11°C para os complexos, portanto, mais estáveis do que os complexos homólogos comparados. Realizou-se a modelagem por homologia de sua estrutura para verificar a possível razão estrutural desta observação no caso do complexo com ATP. A análise da superfície de potencial eletrostático calculada sugere que vários resíduos de lisina e arginina contribuem para uma carga positiva mais elevada próxima ao sítio de ligação do ATP, o que poderia ser responsável por maior força de interação com o substrato e se refletir em maior estabilidade térmica. AbGAPDH foi purificada em quantidade suficiente para realizar apenas alguns ensaios de cristalização iniciais, entretanto, cristais da enzima não mostraram capacidade de difração quando submetidos aos raios X. A análise por nanoDSF realizada para a forma apo da enzima mostrou que o valor de Tm estimado é comparável àquele reportado para algumas homólogas. Assim, foi realizada a modelagem por homologia de sua estrutura tridimensional. A análise do modelo mostrou que a substituição dos resíduos V, I e L (altamente conservados nas homólogas) por K239 na AbGAPDH poderia dar lugar a interações polares com a porção adenina do cofator. A substituição da F conservada por W240 e a presença da Y136 poderiam propiciar uma interação de empilhamento π-π com um ligante aromático intercalado entre as cadeias laterais destes resíduos. Por fim, o estudo por Dinâmica Molecular da Recombinase A, nativa e mutante L54Q, de Herbaspirillum seropedicae indicou que a perda de atividade da mutante pode estar relacionada à dispersão da capacidade de transdução de sinais intramolecularmente.