Promotores que são reconhecidos por diferentes fatores sigma em Escherichia coli

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Maciel, Joyce Belentani de Souza
• Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/5908436186574161
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal do Amazonas; Instituto de Ciências Biológicas; Brasil; UFAM; Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
• Palavras-chave em Português: Escherichia coli; Proteínas recombinantes; CIENCIAS BIOLOGICAS: GENETICA; Promotores; Fatores sigma; Fase estacionária
• Link de acesso: https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/8964

Introdução: Estratégias genéticas têm sido utilizadas por décadas, melhorando os bioprocessos bacterianos visando a simplificação e custo da produção de proteínas recombinantes. Tais estratégias incluem o desenho de vetores de expressão eficientes e a melhoria das linhagens bacteriana, neste contexto, os promotores são elementos de um vetor de expressão que determinam força e duração da transcrição, e consequentemente, o rendimento da proteína heteróloga a ser produzida. Os promotores bacterianos são reconhecidos pelos fatores sigmas, que são proteínas que se acoplam a RNA polimerase para realizar a transcrição. Os fatores sigmas se ligam aos promotores que respondem a diversas condições ambientais que a célula enfrenta, dentre eles os mais conhecidos são os fatores sigmas 70 e 38, que reconhecem promotores de fase exponencial e estacionária da célula. Objetivo: Design, clonagem e análise de promotores sintéticos reconhecidos pelos fatores sigmas σ70 e σ38 em Escherichia coli. Material e Métodos: A partir do conhecimento dos elementos consensuais dos promotores, reconhecidos pelos fatores sigma 70 e 38 de Escherichia coli, planejou-se um oligonucleotídeo onde mantinham-se as regiões consensuais mais importantes dos dois tipos de promotores e foram degeneradas as sequências de regiões adjacentes que poderiam influenciar na força e especificidade dos promotores. Um oligonucleotídeo parcialmente degenerado de 95 nucleotídeos foi sintetizado por síntese química, amplificado com um par de primers localizados em suas bordas. O amplicon resultante foi digerido com as enzimas de restrição SpeI e NdeI, purificado por eletroforese em gel de agarose 2%, eluido e clonado entre os sítios de SpeI e NdeI do plasmídeo pCDM, dessa forma utilizado como um vetor caça promotor que contém o gene da GFP como repórter. As colônias recombinantes foram escolhidas de acordo com a intensidade de produção da GFP, inicialmente a olho nu, posteriormente por fluorimetria para quantificar a produção. Os promotores sintéticos dos clones escolhidos nessa etapa foram sequenciados e analisados. Resultados e Discussão: Produziu-se em E. coli, uma biblioteca com 1.741.824 possibilidades de sequências construídas por síntese química. A partir de uma clonagem, foram obtidos cerca de 1200 clones recombinantes contendo diferentes promotores, em uma triagem inicial foram escolhidos 66 clones produtores de GFP, e após a confirmação de conterem promotores sintéticos foi feita a análise da expressão de GFP em meio líquido. Foram eleitos 16 clones: 5 que expressam baixos níveis de GFP, 5 níveis médios e 6 altos níveis; sendo alguns deles capazes de atuar na fase exponencial de crescimento, outros na fase estacionária e alguns em ambas as fases. Os novos promotores dos 16 clones escolhidos foram sequenciados e analisados para identificar as regiões consenso – 10, -10 estendidas e -35. Analisou-se também as regiões não consensuais que foram degeneradas, bem como a intensidade de expressão de GFP. Alguns promotores foram modificados no espaçamento entre a posição -10 e a -35 e em um dos clones foimodificada a região -35. Os clones J8, J13 e J14 produziram altos níveis de GFP com mais de 900.000 unidades de fluorescência, e os clones J1, J2 e J3 foram os que produziram menos GFP de todos os clones analisados. Por essa estratégia foi possível obter promotores de diferentes forças e que se expressam em diferentes fases do crescimento celular, sendo que alguns apresentam níveis de expressão surpreendentemente altos com possíveis aplicações na expressão gênica para fins industriais.