Produção das proteínas recombinantes Core, Ns3, Ns4b, Ns5a do vírus da Hepatite C e caracterização da resposta imune humoral

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2014
Autor(a) principal: Neves, Walter Luiz Lima
Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/1581438555369469
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Universidade Federal do Amazonas
Instituto de Ciências Biológicas
Brasil
UFAM
Programa de Pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Hepatite por vírus
Resposta imune
Epidemiologia - Pesquisa
CIENCIAS BIOLOGICAS
Hepatite C
Proteínas
Purificação
Recombinante
Link de acesso: https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/8290
Resumo: Introdução: As infecções hepáticas causadas por vírus estão entre as mais graves, com prevalência no mundo todo. Segundo dados da OMS, o Vírus da Hepatite C (HCV) acomete cerca de 170 milhões de pessoas em todo o mundo, o que corresponde a aproximadamente 3% da população mundial. Desse total, nota-se que a maioria dos indivíduos (80%) não desenvolve resposta virológica sustentada, evoluindo para infecção crônica. Objetivo: Produzir, expressar e purificar as proteínas recombinantes CORE, NS3, NS4b e NS5a do vírus da Hepatite C, otimizadas para E. coli e analisar a reatividade destas proteínas frente aos soros de pacientes com hepatite C crônica. Material e Métodos: Os genes recombinantes das proteínas CORE (594pb), NS3 (897pb), NS4b (804pb), NS5a F1 (678pb) e NS5a F2 (692pb) foram construídos e otimizados para expressão em E. coli BL21 (DE3) pLysS. Sítios de enzimas de restrição foram adicionados nas sequências para realizar a subclonagem em vetor pRSET, o qual inclui a sequência de aminoácidos da proteína da cauda 6XHIS. Soros de pacientes com hepatite C crônica obtidos em estudos prévios, foram usados para avaliar a reatividade contra as proteínas recombinantes produzidas. Resultados e conclusão: Logo, as proteínas recombinantes CORE, NS3, NS4b, NS5a F1 e NS5a F2 foram expressas com sucesso em hospedeiro E.coli. Estas foram purificadas em condições nativa e desnaturada utilizando coluna de níquel. As proteínas recombinantes CORE e NS5 F2 foram imunorreativas para um pool de soros de pacientes com hepatite C crônica, não sendo detectada reatividade com soros negativos. Não foi observado nenhuma reatividade para porção N-terminal da proteína NS5a. Estudos futuros buscaram analisar a reatividade individual de um grande número pacientes, para cada proteína recombinante.
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Material e Métodos: Os genes recombinantes das proteínas CORE (594pb), NS3 (897pb), NS4b (804pb), NS5a F1 (678pb) e NS5a F2 (692pb) foram construídos e otimizados para expressão em E. coli BL21 (DE3) pLysS. Sítios de enzimas de restrição foram adicionados nas sequências para realizar a subclonagem em vetor pRSET, o qual inclui a sequência de aminoácidos da proteína da cauda 6XHIS. Soros de pacientes com hepatite C crônica obtidos em estudos prévios, foram usados para avaliar a reatividade contra as proteínas recombinantes produzidas. Resultados e conclusão: Logo, as proteínas recombinantes CORE, NS3, NS4b, NS5a F1 e NS5a F2 foram expressas com sucesso em hospedeiro E.coli. Estas foram purificadas em condições nativa e desnaturada utilizando coluna de níquel. As proteínas recombinantes CORE e NS5 F2 foram imunorreativas para um pool de soros de pacientes com hepatite C crônica, não sendo detectada reatividade com soros negativos. Não foi observado nenhuma reatividade para porção N-terminal da proteína NS5a. Estudos futuros buscaram analisar a reatividade individual de um grande número pacientes, para cada proteína recombinante.Introduction: Liver infections caused by viruses are among the most serious ones, with worldwide prevalence. According to WHO data, the Hepatitis C Virus (HCV) affects approximately 170 million people around the world, representing approximately 3% of world population. Of this total, the majority of individuals (80%) did not develop sustained virologic response, progressing to chronic infection. Objective: Production, expression and purification of HCV proteins CORE, NS3, NS4b and NS5a in E. coli and analysis of its reactivity with serum of chronic hepatitis C patients. Methods: Recombinant genes of CORE (594pb), NS3 (897pb), NS4b (804pb), NS5a F1 (678pb) and NS5a F2 proteins were constructed (692pb) for optimized expression in E. coli BL21 (DE3) pLysS. Restriction enzymes sites were added to the sequences for subcloning in pRSET, which include a 6xHIS tagged in the recombinant protein amino acid sequence. Sera of patients with chronic hepatitis C obtained in previous study were used in western blot to evaluate its reactivity with recombinant proteins produced. Results and conclusion: The recombinant proteins were expressed in E. coli showed a higher concentration in the insoluble portion. Each protein was purified in native and denatured condition using nickel column. CORE and NS5a F2 proteins were reactive to antibodies present in the sera of patients, and did not reacted with negative patients sera. Any reactivity was observed against the N-terminal portion of NS5a. Further studies will try to analyze individual reactivity of a large number of patients against each recombinant protein.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorFAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do AmazonasUniversidade Federal do AmazonasInstituto de Ciências BiológicasBrasilUFAMPrograma de Pós-graduação em Imunologia Básica e AplicadaMarie, Adriana Malheiro Allehttp://lattes.cnpq.br/2627415957053194Nogueira, Paulo Afonsohttp://lattes.cnpq.br/8053450182210137Anibal, Fernanda Freitashttp://lattes.cnpq.br/4918261968772806Neves, Walter Luiz Limahttp://lattes.cnpq.br/15814385553694692021-06-01T03:17:59Z2014-09-29info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfNEVES, Walter Luiz Lima. Produção das proteínas recombinantes Core, Ns3, Ns4b, Ns5a do vírus da Hepatite C e caracterização da resposta imune humoral. 2014 83 f. Dissertação (Mestrado em Imunologia Básica e Aplicada) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus (AM), 2014.https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/8290porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAMinstname:Universidade Federal do Amazonas (UFAM)instacron:UFAM2021-06-01T05:04:13Zoai:https://tede.ufam.edu.br/handle/:tede/8290Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://200.129.163.131:8080/PUBhttp://200.129.163.131:8080/oai/requestddbc@ufam.edu.br||ddbc@ufam.edu.bropendoar:65922021-06-01T05:04:13Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM - Universidade Federal do Amazonas (UFAM)false
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