Geração e caracterização de linhagens de Trypanosoma cruzi expressando proteínas fluorescentes como ferramentas para pesquisa em Doença de Chagas

• Ano de defesa: 2007
• Autor(a) principal: Simone da Fonseca Pires
• Orientador(a): Andrea Mara Macedo
• Banca de defesa: Santuza Maria Ribeiro Teixeira, Vania Ferreira Prado, Evanguedes Kalapothakis, Alvaro Jose Romanha, Renato Arruda Mortara
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Minas Gerais
• Palavras-chave em Português: Bioquimica
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/1843/UCSD-84XQK3

Sistemas de transformação estável vêm sendo descritos para várias espécies de tripanosomatídeos como Leishmania spp, Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi . A transfecção pode ser mediada pela integração de genes exógenos no genoma da célula hospedeira, que ocorre por recombinação homóloga ou através da manutenção dosvetores transformados na forma episomal. Com o objetivo de gerar parasitos que expressassem proteínas fluorescentes de forma estável, formas epimstigotas do T. cruzi foram transfectadas com o vetor de expressão denominado pROCKGFP/RFPNeo, que leva a integração das proteínas verde (GFP) e vermelha (RFP) fluorescentes no loco de-tubulin via recombinação homóloga com esse loco. Clones dos parasitos transfectados foram obtidos por diluição seriada em placas de 96 poços e/ou placas de ágar-sangue. Foi avaliada a estabilidade na expressão de GFP e RFP entre as populações (parasitos não clonados) e os clones. Os parasitos foram cultivados por 1 e 2 meses na presença de G418 (200 e 400 g/mL) e na ausência da droga e em seguida analisados pela técnica de citometria de fluxo. Foi observado que os clones expressando GFP e RFP foram capazes de manter a porcentagem de parasitos fluorescentes na ausência do antibiótico,enquanto que nas populações, houve redução da porcentagem de células verdes e vermelhas fluorescentes. As análises de chromoblot mostraram a integração de GFP e RFP no loco de -tubulina. Os parasitos transfectados mostraram infectividade semelhante ao não transfectado em culturas de células Vero e a expressão das proteínasfluorescentes pôde ser facilmente visualizada nas três formas do ciclo de vida do parasito por microscopia confocal. Parasitos expressando GFP foram capazes de infectar camundongos GKO (interferon-gama knockout) e apresentaram alta parasitemia 12 dias após a infecção. Foram observados parasitos fluorescentes no coração e diafragma dos animais. Cultura de células co-infectadas com parasitos da cepa Tulahuén expressando as duas diferentes fluorescências, mostraram que dois parasitos diferentes podem infectar a mesma célula. Também foram observadas células co-infectadas com parasitos transfectados, derivados de cepas pertencentes às distintas linhagens de T. cruzi, Col1.7G2GFP (T. cruzi I) e TulahuénRFP (T. cruzi II). Os parasitos gerados expressando GFP e RFP constituem, portanto uma nova ferramenta para o estudo de vários aspectos da biologia do T. cruzi. Com eles podemos estudar mecanismos de invasão celular, troca genética, susceptibilidade às drogas e inúmeros aspectos dainteração parasito-hospedeiro invertebrado e vertebrado, neste último, enfatizando o modelo histotrópico-clonal da doença de Chagas em modelos animais.