Purificação e caracterização parcial de inibidores de serino protease e sua influencia sobre a viabilidade espermática equina nos processos de resfriamento e congelamento

• Ano de defesa: 2008
• Autor(a) principal: Andre Belico de Vasconcelos
• Orientador(a): Monique de Albuquerque Lagares
• Banca de defesa: Marcos Xavier da Silva, Eustaquio Resende Bittar, Olindo Assis Martins Filho, Marc Roger Jean Marie Henry
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Minas Gerais
• Palavras-chave em Português: Espermatozóide eqüino; inibidores de serino protease; congelamento
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/1843/LGPD-7Q2K54

A criopreservação de sêmen oferece grandes vantagens para os programas de reprodução eqüina, promovendo ganho genético. No entanto, a criopreservação reduz a qualidade espermática devido principalmente a alterações das membranas espermáticas semelhante às que ocorrem durante a capacitação espermática. A utilização de proteínas do plasma seminal no processo de criopreservação poderia minimizar os efeitos deletérios sobre o espermatozóide.Principalmente, dos efeitos resultantes da ação do processo de criopreservação tornando-se de grande valia para o melhoramento da qualidade do espermatozóide eqüino resfriado e póscongelamento. Deste modo, os objetivos deste trabalho foram: Identificar procedimentos preventivos para os efeitos deletérios da criopreservação, investigar a eficácia da técnica de cromatografia de exclusão molecular no estudo de proteínas do plasma seminal de mamíferos, isolar e identificar a presença de inibidores de serino proteases no plasma seminal eqüino, explorar comparativamente os inibidores naturais e sintéticos de serino protease quanto á sua atividade inibitória no mecanismo enzimático da serino protease (tripsina-bovina), introduzir inibidores naturais e sintéticos de serino proteases no meio diluidor de congelamento e resfriamento do sêmen eqüino, avaliar as qualidades morfométricas do espermatozóide eqüino através da citrometria de fluxo e comparar a eficiência do Azul de Tripan e do Iodeto de Propídio na avaliação da integridade física do espermatozóide eqüino através da citrometria de fluxo. Foram realizados três experimentos distintos. O primeiro destes experimentos testou a aplicação da técnica de cromatografia de exclusão molecular na identificação das proteínas do plasma seminal de três diferentes espécies animais: eqüina canina; caprina. Encontraram-se evidências de a cromatografia de exclusão molecular seja um procedimento satisfatório para identificação das proteínas do plasma seminal. O segundo experimento isolou, identificou e avaliou o inibidor de serino protease presente no plasma seminal eqüino e seu potencial de inibição. Também explorou comparativamente os inibidores naturais e sintéticos de serino protease quanto á sua atividade inibitória, avaliou a correlação entre concentração total de proteína e de inibidor de serino protease do plasma seminal com a maturidade sexual dos garanhões. Foram identificadas proteínas ativas com uma massa de molecular de 6.3-7.0 kDa usando espectrometria de massa. Os garanhões mais velhos mostraram uma redução na concentração total de proteína do plasma seminal, mas mantiveram a concentração dos inibidores de serino proteinase com diferença não significativa entre as médias. Também foram encontrados diferentes isoformas do inibidor de serino proteinase no sêmen de todos os garanhões. O terceiro experimento verificou o efeito da adição dos inibidores de serino protease ao meio de resfriamento e de congelamento do sêmen eqüino. Não houve diferença significativa entre o controle e os grupos tratados quanto à porcentagem de espermatozóide com motilidade progressiva, membrana plasmática funcional, integridade de membrana plasmática, acrossoma intacto e fragmentação de DNA. Não foi observada diferença significativa entre o grupo controle e os grupos tratados, depois da indução da reação de acrossômica com Cálcio Ionóforo A23187, sugerindo que os inibidores de serino protease não bloquearam a capacitação e reação acrossômica. Foi possível comprovar a eficácia dos dois cromóforos Azul de Tripan e Iodeto de Propídio na avaliação da integridade física do espermatozóide eqüino por meio de citometria de fluxo. A utilização de um corante com um valor mais baixo como o Azul de Tripan torna-se de grande valia aos estudos da avaliação do espermatozóide eqüino, proporcionando uma redução do custo da técnica na citometria de fluxo. A técnica de cromatografia de exclusão molecular apresentou pontos importantes para purificação de proteínas do plasma seminal de mamíferos; foi possível isolar e identificar a presença de inibidores de serino proteases no plasma seminal eqüino, além de se observar que esses apresentam isoforma; o potencial de inibição dos inibidores naturais de serino proteases é similar ao dos inibidores sintéticos. Contudo, não foram encontradas diferenças significativas entre o controle e os grupos experimentais quanto à ação dos inibidores na melhoria da qualidade do espermatozóide eqüino criopreservado. Recomendam-se novos estudos sobre a formação das isoformas, os mecanismos de interação do peptídeo com as células espermáticas, determinação do N-terminal e a adição de doses maiores do inibidor de serino protease em meios contendo diferentes crioprotetores