Avaliação da produção de citocinas intracelulares por monócitos e neutrófilos do sangue periférico humano infectados com L. braziliensis: incorporação de um novo parâmetro ao ensaio pré-clínico funcional multiparamétrico baseado em citometria de fluxo

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Bruno Generoso Faria
• Orientador(a): Elaine Maria de Souza Fagundes
• Banca de defesa: Frédéric Jean Georges Frézard, Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Minas Gerais
• Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Fisiologia e Farmacologia
• Departamento: ICB - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAS
• País: Brasil
• Palavras-chave em Português: Inovação metodológica; Citometria de fluxo; Descoberta de fármacos
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/1843/35680

Assim como as demais doenças negligenciadas, as opções terapêuticas relacionadas ao tratamento das leishmanioses são ainda consideradas insuficientes, possuindo problemas como baixa eficácia, alta toxicidade e emergência de cepas resistentes. Este cenário é ainda agravado quando consideramos o número limitado de programas com foco nas áreas de inovação e descoberta de fármacos para doeças negligenciadas. Neste contexto, maiores esforços são necessários para a descoberta e desenvolvimento de novos potenciais protótipos com atividade leishmanicida, os quais são avaliados por ensaios biológicos baseados em células. Em 2012, nosso grupo descreveu a padronização de um novo ensaio funcional multiparamétrico por citometria de fluxo que permitiu avaliar simultâneamente a atividade leishmanicida e citotóxica (imunotóxica) de dois fármacos utilizados na clínica, o Glucantime® e a Anfotericina B. O método compreende o ensaio de internalização de formas promastigotas de Leishmania braziliensis marcadas com fluorocromo, por monócitos e neutrófilos do sangue periférico humano e análise simultânea de imunotoxicidade (avaliação de apoptose e necrose) por citometria de fluxo. No presente trabalho, validamos este ensaio funcional multiparamétrico, sendo utilizados os fármacos Anfotericina B e Glucantime®, em culturas de sangue periférico humano (n=17 doadores saudáveis) na presença ou não de promastigotas vivas de L. braziliensis. Neste sentido, foram avaliados nas populações de monócitos e neutrófilos o possível efeito citotóxico, a interação entre estes fagócitos e L. braziliensis, além dos níveis de citocinas intracelulares (IL-10, TNF-α e IL-12). Os resultados demonstraram que houve significante redução da porcentagem de interação entre monócitos e neutrófilos com o parasito na presença dos tratamentos (Glucantime® e Anfotericina B) em comparação com o grupo não tratado. A análise do perfil de citocinas intracitoplasmáticas demonstrou aumento de IL-10, IL-12 e TNF- nas culturas tratadas com Glucantime® a Anfotericina B na presença de formas promastigotas vivas de L. braziliensis, em relação as culturas controles. Estes resultados indicam que o novo ensaio funcional provou ser extremamente útil como um método confirmatório para a seleção de substâncias promissoras com atividade anti-Leishmania, permitindo o acesso a diferentes parâmetros importantes no contexto da descoberta de fármacos. Esta inovação metodológica é considerada também mais complexa, por apresentar maior sensibilidade em função de sua natureza multiparamétrica e funcional, permitindo, de forma quantitativa, a seleção de compostos para estudos subsequentes nos diferentes estágios da descoberta de fármacos, auxiliando também estudos in vivo, visando a redução da utilização de animais nestas fases.