Duplo papel da proteína MSH2 no reparo de erros de pareamento no DNA e na resposta ao estresse oxidativo em tripanosomatídeos

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2015
Autor(a) principal: Viviane Grazielle da Silva lattes
Orientador(a): Santuza Maria Ribeiro Teixeira lattes
Banca de defesa: Fabiana Simão Machado, Silvane Maria Fonseca Murta, Maria Carolina Quartim Barbosa Elias Sabbaga, Sérgio Schenkman
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Universidade Federal de Minas Gerais
Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Imunologia
Departamento: ICB - DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
País: Brasil
Palavras-chave em Português:
Link de acesso: http://hdl.handle.net/1843/35469
Resumo: Diversos mecanismos estão envolvidos na manutenção da integridade genômica de qualquer organismo, entre eles o Sistema de Reparo de Erros de Pareamento (MMR). Responsável principalmente pelo reconhecimento de erros de pareamento e alças de inserção e deleção que podem ocorrer após a replicação do DNA, o principal componente do MMR é formado pelas proteínas MutS e MutL encontradas em procariotos e diversas proteínas MSH e MLH presentes em eucariotos. Estudos anteriores voltados para a caracterização da via de MMR nos tripanosomatídeos Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei revelaram dados sugerindo o envolvimento dessas proteínas também na resposta aos danos oxidativos no DNA. Em T. cruzi a análise da sequência da proteína MSH2 em diferentes cepas do parasito mostrou a existência de três diferentes isoformas da proteína na população do parasito. Para investigar o papel dessa proteína, foram produzidas linhagens de epimastigotas de T. cruzi nas quais um ou ambos os alelos do gene msh2 foram deletados. Uma vez que clones contendo a deleção de um dos alelos mostraram-se mais susceptíveis ao tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2), foi sugerido o envolvimento dessa proteína na resposta ao dano oxidativo no DNA. Resultado semelhante foi observado para clones nocautes de msh2 em T. brucei: formas sanguíneas nas quais um ou ambos alelos de msh2 foram deletados mostraram-se mais susceptíveis ao tratamento com H2O2 quando comparados aos parasitos selvagem. Por outro lado, surpreendentemente, linhagens de epimastigotas de T. cruzi contendo a deleção dos dois alelos de msh2, assim como as linhagens nocaute de msh2 geradas nas formas procíclicas de T. brucei, apresentaram maior resistência ao tratamento com H2O2 quando comparados aos parasitos selvagens. No T. cruzi a deleção dos dois alelos do gene msh2 resultou também em uma maior capacidade de sobrevivência no interior de macrófagos, uma célula capaz de gerar altos níveis de espécies reativas de oxigênio. Com a finalidade de avaliar se a proteína MSH2 estaria envolvida na resposta ao estresse oxidativo de uma maneira independente de outras proteínas do MMR foram gerados clones de T. cruzi msh6 heminocautes, os quais apresentaram também uma maior susceptibilidade ao estresse oxidativo. A localização nuclear das duas proteínas MSH2 e MSH6 foi obtida por meio da análise de microscopia de fluorescência dessas proteínas em fusão com tag de c-myc e HA ou RFP em parasitos transfectados. Proteínas capazes de interagir com o MSH2 foram investigadas por meio da geração de parasitos nos quais a proteína TbMSH6 foi expressa com um tag de HA e a proteína MSH2 expressa com um tag de myc. Ensaios de coimunoprecipitação com esses parasitos mostraram que a proteína MSH2 de T. brucei interage com MSH3 e MSH6, como esperado, porém não revelaram nenhuma interação adicional com outras proteínas mesmo após tratamento com agentes genotóxicos como o MNNG e H2O2. Tomados em conjunto, os nossos dados nos levaram a formular a hipótese de que a deleção dos dois alelos de msh2 nas formas epimastigotas de T. cruzi e nas formas procíclicas de T. brucei teriam maior impacto sobre a capacidade desses parasitos de resistir ao estresse oxidativo gerado pelo metabolismo essencialmente aeróbico dessas formas, as quais estão presentes nos vetores invertebrados desses parasitos. As diferenças no fenótipo dos mutantes de msh2 observadas nas formas sanguíneas do T. brucei, poderiam ser explicadas pelas diferenças no metabolismo dessas formas, o qual, em contraste com as formas procíclicas, é anaeróbico e gera, portanto, menos ROS. A hipótese de que os mutantes de msh2 na forma procíclica tenham que se adaptar para sobreviver na ausência de MSH2 foi corroborada pela análise comparativa da expressão gênica global que mostrou a diminuição nos níveis da enzima Fumarato Redutase NADH-dependente, envolvida na geração de ROS em linhagens msh2 nocaute de T. brucei.
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Estudos anteriores voltados para a caracterização da via de MMR nos tripanosomatídeos Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei revelaram dados sugerindo o envolvimento dessas proteínas também na resposta aos danos oxidativos no DNA. Em T. cruzi a análise da sequência da proteína MSH2 em diferentes cepas do parasito mostrou a existência de três diferentes isoformas da proteína na população do parasito. Para investigar o papel dessa proteína, foram produzidas linhagens de epimastigotas de T. cruzi nas quais um ou ambos os alelos do gene msh2 foram deletados. Uma vez que clones contendo a deleção de um dos alelos mostraram-se mais susceptíveis ao tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2), foi sugerido o envolvimento dessa proteína na resposta ao dano oxidativo no DNA. 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Com a finalidade de avaliar se a proteína MSH2 estaria envolvida na resposta ao estresse oxidativo de uma maneira independente de outras proteínas do MMR foram gerados clones de T. cruzi msh6 heminocautes, os quais apresentaram também uma maior susceptibilidade ao estresse oxidativo. A localização nuclear das duas proteínas MSH2 e MSH6 foi obtida por meio da análise de microscopia de fluorescência dessas proteínas em fusão com tag de c-myc e HA ou RFP em parasitos transfectados. Proteínas capazes de interagir com o MSH2 foram investigadas por meio da geração de parasitos nos quais a proteína TbMSH6 foi expressa com um tag de HA e a proteína MSH2 expressa com um tag de myc. Ensaios de coimunoprecipitação com esses parasitos mostraram que a proteína MSH2 de T. brucei interage com MSH3 e MSH6, como esperado, porém não revelaram nenhuma interação adicional com outras proteínas mesmo após tratamento com agentes genotóxicos como o MNNG e H2O2. Tomados em conjunto, os nossos dados nos levaram a formular a hipótese de que a deleção dos dois alelos de msh2 nas formas epimastigotas de T. cruzi e nas formas procíclicas de T. brucei teriam maior impacto sobre a capacidade desses parasitos de resistir ao estresse oxidativo gerado pelo metabolismo essencialmente aeróbico dessas formas, as quais estão presentes nos vetores invertebrados desses parasitos. As diferenças no fenótipo dos mutantes de msh2 observadas nas formas sanguíneas do T. brucei, poderiam ser explicadas pelas diferenças no metabolismo dessas formas, o qual, em contraste com as formas procíclicas, é anaeróbico e gera, portanto, menos ROS. A hipótese de que os mutantes de msh2 na forma procíclica tenham que se adaptar para sobreviver na ausência de MSH2 foi corroborada pela análise comparativa da expressão gênica global que mostrou a diminuição nos níveis da enzima Fumarato Redutase NADH-dependente, envolvida na geração de ROS em linhagens msh2 nocaute de T. brucei.Different mechanisms are involved in maintaining genomic stability; among them is the DNA Mismatch Repair (MMR). Mainly responsible for the recognition of mismatches and insertion/deletion loops after DNA replication, the main component of MMR is formed by MutS and MutL proteins that are found in prokaryotes and different MutS homologs (MSH) e MutL homologs (MLH), present in eukaryotes. Previous studies aiming to characterize the MMR pathway in the trypanosomatide parasites Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei provided data suggesting the involvement of these proteins also in the response to DNA oxidative damages. In T. cruzi, sequence analysis of MSH2 from different strains of the parasite showed the existence of three different isoforms of this protein in the parasite population. With the aim of further investigate the role of this protein, we generated lineages of epimastigote forms of T. cruzi with one or both alleles of msh2 gene deleted. Clones with one allele msh2 deleted showed increased susceptibility to hydrogen peroxide (H2O2) treatment, suggesting the involvement of this protein in the response to DNA oxidative damage. Similar results were observed for msh2 knockouts in T. brucei: bloodstream forms with one or two alleles of msh2 deleted showed increased susceptibility to H2O2 when compared to wild type parasites. However, similar to msh2 null mutants generated in the procyclic form of T. brucei, T. cruzi lineages with both msh2 alleles deleted showed increased tolerance to H2O2 treatment when compared to wild type parasites. T. cruzi msh2 null mutants also have increased capacity to survive to intracellular reactive oxygen species generated during macrophages infection. With the aim of evaluating whether MSH2 is involved in the oxidative stress response in a way that is independent of other MMR proteins, T. cruzi single allele msh6 knockouts were also generated. These T. cruzi msh6 mutants were also more susceptible to oxidative stress. A nuclear localization of the two proteins, MSH2 and MSH6, were obtained by fluorescence microscopy analysis of c-myc tag and HA tag or RFP fused to these proteins in transfected parasites. Proteins with the capacity to interact with MSH2 were investigated using parasites expressing TbMSH6 in fusion with a HA tag, and TbMSH2 expressed with a myc tag. Co-immunoprecipitation assays with parasites expressing the tagged proteins showed that T. brucei MSH2 interacts with MSH3 and MSH6, as expected, but no additional interactions were observed even after treatment with genotoxic agents such as MNNG and H2O2. Taken together our results lead us to formulate the hypothesis that the deletion of two alleles of msh2 in epimastigote form of T. cruzi and procyclic form of T. brucei has a strong impact on the capacity of these parasites to resist to the oxidative stress generated by its essentially aerobic metabolism. Differences in the phenotype of msh2 mutants observed in the bloodstream form of T. brucei could be explained by metabolic differences, since this form, in contrast to procyclic forms, has an anaerobic metabolism, which generate less ROS. The hypothesis that procyclic msh2 mutants had to adapt to survive in the absence of MSH2 was corroborated by the comparative analysis of global genic expression that showed a reduced expression of the enzyme NADH-dependent fumarate reductase in the mutants compared to WT parasites, an enzyme involved in ROS generation.CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoCAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorporUniversidade Federal de Minas GeraisPrograma de Pós-Graduação em Bioquímica e ImunologiaUFMGBrasilICB - DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIAProteína 2 homóloga a MutSReparo de erro de pareamento de DNAEstresse oxidativoTrypanosoma cruziTrypanosoma brucei bruceiBioquímicaImunologiaDuplo papel da proteína MSH2 no reparo de erros de pareamento no DNA e na resposta ao estresse oxidativo em tripanosomatídeosinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALTese_Viviane_Final_Corrigida.pdfTese_Viviane_Final_Corrigida.pdfapplication/pdf35234403https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/35469/1/Tese_Viviane_Final_Corrigida.pdf7683a057c98ffdda8b71699f4efdec2bMD51LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82119https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/35469/2/license.txt34badce4be7e31e3adb4575ae96af679MD521843/354692021-03-29 14:54:56.213oai:repositorio.ufmg.br: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Repositório de PublicaçõesPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2021-03-29T17:54:56Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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