Purificação, caracterização e atividade imunomoduladora de uma lectina da semente da Castanha-da-índia (Aesculus hippocastanum L.)
Ano de defesa: | 2020 |
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Tipo de documento: | Dissertação |
Tipo de acesso: | Acesso aberto |
Idioma: | por |
Instituição de defesa: |
Universidade Federal de Pernambuco
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Programa de Pós-Graduação: |
Programa de Pos Graduacao em Bioquimica e Fisiologia
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Departamento: |
Não Informado pela instituição
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País: |
Brasil
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Palavras-chave em Português: | |
Link de acesso: | https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/40063 |
Resumo: | A busca por agentes biológicos com capacidade imunomoduladora visa fornecer resposta terapêutica para diversas doenças. Nesse contexto, as lectinas (proteínas que se ligam a carboidratos) apresentam elevado potencial imunomodulador, devido a sua capacidade de modular células imunológicas através da interação com proteínas de superfície gerando uma cascata de sinalização. A Aesculus hippocastanum, conhecida como castanheira-da-índia, é comumente utilizada para produção de fitoterápicos com atividades anti-inflamatória e vasoprotetora. O objetivo desse trabalho foi purificar e caracterizar uma lectina das sementes de A. hippocastanum (AhSL) e avaliar a sua citoxicidade e efeito imunomodulador sobre esplenócitos de camundongo. A farinha das sementes foi submetida à extração (10%, p/v) de proteínas em NaCl 0,15 M e o extrato foi submetido à cromatografia em coluna de DEAE Sephadex equilibrada com tampão Tris-HCl 0,1 M pH 8,0. As proteínas adsorvidas foram eluídas com o mesmo tampão, porém contendo NaCl 1,0 M, dialisadas e avaliadas quanto às atividades hemaglutinante (AH) e inibidora de tripsina (AIT). Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) foi realizada para avaliar a homogeneidade e a composição em subunidades de AhSL. A especificidade de ligação a carboidratos, o efeito de cátions divalentes na AH e a estabilidade da AH frente ao aquecimento (30–100°C) e após incubação em diferentes valores de pH (1,0–9,0) também foram avaliadas. Análises fluorimétricas tabém foram realizadas. Os esplenócitos de camundongo BALB/c foram tratados com AhSL (3,12– 50,00 μg/mL) e foi avaliada a ocorrência de apoptose e/ou necrose. A atividade imunomoduladora de AhSL (12,5 µg/mL) foi avaliada através da determinação dos níveis de citocinas e óxido nítrico (NO). AhSL (fator de purificação: 68,8) mostrou uma única banda polipeptídica em PAGE para proteínas ácidas e duas bandas polipeptídicas de aproximadamente 68 e 124 kDa em SDS-PAGE. Sua AH foi inibida por monossacarídeos, dissacarídeos e glicoproteínas, principalmente o acido n-acetilneuroaminico. A AH foi estável após o aquecimento em todas as temperaturas e incubação na faixa de pH 4,0–8,0 e sua atividade específica não foi alterada por nenhum cátion testado. Análise fluorimétrica revelou que a conformação da lectina não foi alterada após aquecimento a 100 ºC e incubação em diferentes valores de pH. AhSL também mostrou AIT específica de 1.280,31 U/mg. A lectina não foi tóxica para os esplenócitos e induziu a liberação de interleucinas 10 e 6, fator de necrose tumoral α e óxido nítrico, por fim a lectina não induziu despolarização de membrana mitocondrial e não aumentou os níveis de EROs citsólica ou mitocondrial. Em conclusão, uma proteína multifuncional (com atividades lectínica, inibidora de tripsina e imunomoduladora) foi purificada a partir de sementes de A. hippocastamum. |
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FARIAS, Maxmiliana Fernanda Alves Mariano Soares dehttp://lattes.cnpq.br/7773675381508445http://lattes.cnpq.br/0869167120016962http://lattes.cnpq.br/7745355395238053NAPOLEÃO, Thiago HenriqueSANTOS, Nataly Diniz de Lima2021-05-12T20:24:17Z2021-05-12T20:24:17Z2020-06-30FARIAS, Maxmiliana Fernanda Alves Mariano Soares de. Purificação, caracterização e atividade imunomoduladora de uma lectina da semente da Castanha-da-índia (Aesculus hippocastanum L.). 2021. Dissertação (Mestrado em Bioquímica e Fisiologia) - Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2020.https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/40063A busca por agentes biológicos com capacidade imunomoduladora visa fornecer resposta terapêutica para diversas doenças. Nesse contexto, as lectinas (proteínas que se ligam a carboidratos) apresentam elevado potencial imunomodulador, devido a sua capacidade de modular células imunológicas através da interação com proteínas de superfície gerando uma cascata de sinalização. A Aesculus hippocastanum, conhecida como castanheira-da-índia, é comumente utilizada para produção de fitoterápicos com atividades anti-inflamatória e vasoprotetora. O objetivo desse trabalho foi purificar e caracterizar uma lectina das sementes de A. hippocastanum (AhSL) e avaliar a sua citoxicidade e efeito imunomodulador sobre esplenócitos de camundongo. A farinha das sementes foi submetida à extração (10%, p/v) de proteínas em NaCl 0,15 M e o extrato foi submetido à cromatografia em coluna de DEAE Sephadex equilibrada com tampão Tris-HCl 0,1 M pH 8,0. As proteínas adsorvidas foram eluídas com o mesmo tampão, porém contendo NaCl 1,0 M, dialisadas e avaliadas quanto às atividades hemaglutinante (AH) e inibidora de tripsina (AIT). Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) foi realizada para avaliar a homogeneidade e a composição em subunidades de AhSL. 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Aesculus hippocastanum, known as horse chestnut, is commonly used to produce herbal medicines with anti inflammatory and vasoprotective activities. The objective of this work was to purify and characterize a lectin from A. hippocastanum seeds (AhSL) and to evaluate its cytoxicity and immunomodulatory effect on mouse splenocytes. The seed meal was subjected to extraction (10%, w/v) of proteins in 0.15 M NaCl and the extract was subjected to DEAE-Sephadex column chromatography equilibrated with 0.1 M Tris-HCl pH 8.0. The adsorbed proteins were eluted with the same buffer, but containing 1.0 M NaCl, dialyzed and evaluated for hemagglutinating (HA) and trypsin inhibitor (TIA) activities. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was performed to assess homogeneity and subunit composition in AhSL. The specificity of binding to carbohydrates, the effect of divalent cátions on HÁ and the stability of HA toward heating (30–100 °C) and after incubation at different pH values (1.0–9.0) were also evaluated. Fluorometric analyses were also performed. BALB/c mouse splenocytes were treated with AhSL (3.12–50.00 μg/mL) and the occurrence of apoptosis and/or necrosis was evaluated. The immunomodulatory activity of AhSL (12.5 µg/mL) was assessed by determining the levels of cytokines and nitric oxide (NO). AhSL (purification factor: 68.8) showed a single polypeptide band in PAGE for acidic proteins and two polypeptide bands of approximately 68 and 124 kDa in SDS-PAGE. Its HA was inhibited by monosaccharides, disaccharides and glycoproteins, mainly N-acetylneuroaminic acid. The HA was stable after heating at all temperatures and incubation in the pH range 4.0–8.0 and its specific activity was not altered by any cation tested. Fluorometric analysis revealed that the lectin conformation was not altered after heating to 100 ºC and incubation at different pH values. AhSL also showed a specific TIA of 1,280.31 U/mg. Lectin was not toxic to splenocytes and induced the release of interleukins 10 and 6, tumor necrosis factor α and nitric oxide. Finally, lectin did not induce mitochondrial membrane depolarization and did not increase the levels of cytosolic or mitochondrial ROS. In conclusion, a multifunctional protein (with lectin, trypsin inhibitor and immunomodulatory activities) was purified from A. hippocastamum seeds.porUniversidade Federal de PernambucoPrograma de Pos Graduacao em Bioquimica e FisiologiaUFPEBrasilAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/openAccessLectinaToxicidade-testesMatéria médica vegetalPurificação, caracterização e atividade imunomoduladora de uma lectina da semente da Castanha-da-índia (Aesculus hippocastanum L.)info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesismestradoreponame:Repositório Institucional da UFPEinstname:Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)instacron:UFPECC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8811https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/40063/2/license_rdfe39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34MD52LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; 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