Desenvolvimento de vetor para carreamento de RNA de interferência utilizando Pichia pastoris como sistema de entrega

• Ano de defesa: 2026
• Autor(a) principal: MELO, Karina Mayumi Tani Bezerra de
• Orientador(a): PITA, Will de Barros
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Pernambuco
• Programa de Pós-Graduação: Programa de Pos Graduacao em Biotecnologia
• País: Brasil
• Palavras-chave em Português: RNA de interferência; Delivery gênico; Pichia pastoris
• Link de acesso: https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/71461

O microambiente tumoral (TME) é um ambiente heterogêneo e apresenta um papel importante no desenvolvimento tumoral. É constituído por componentes celulares e extracelulares que interagem entre si, favorecendo diferentes processos carcinogênicos. Devido ao seu papel, modular seus componentes se mostra uma alternativa interessante para gerar respostas antitumorais. Dentre esses componentes, macrófagos associados ao tumor (TAMs), mais especificamente do perfil M2, se tornam potenciais alvos de estudo. Esta classe de macrófagos apresenta um perfil pró-tumoral, estimulando a imunossupressão e a carcinogênese. Um receptor responsável pela polarização e manutenção de M2, é o receptor do fator estimulante de colônia 1 (CSF1R). O bloqueio desta via de sinalização demonstra potencial na diminuição de M2 e reversão do TME. Assim, esse bloqueio se torna uma estratégia interessante para cânceres com uma alta expressão do CSF1R, como o câncer cervical. Uma maneira de modular a expressão desse receptor é usando o RNA de interferência (RNAi). Entretanto, uma das dificuldades para estabelecer abordagens de imunomodulação é a garantia de um delivery específico para as células adequadas. Leveduras, como a Pichia pastoris, têm se mostrado carreadores interessantes devido a sua interação com receptores de macrófagos e células dendríticas, e tem emergido como potenciais vetores para entrega de DNA, RNAm e RNAi. Desse modo, o presente trabalho visa o desenvolvimento de um vetor contendo o shRNA para ser carreado pela levedura P. pastoris, tendo como alvo o CSF1R para modular a expressão de macrófagos M2, visando induzir um perfil antitumoral nos macrófagos associados a tumores HPV-positivos. Para isso, diferentes sequências de short hairpin RNA (shRNA) foram selecionadas, tendo como alvo a sequência do CSF1R de Mus musculus de acordo com o seu potencial de se ligar ao RNAm e de não interferir na expressão de outros genes. Durante a execução do trabalho, uma sequência foi inserida no vetor de expressão pLT-hU6-miR30. Esse vetor construído, além de ser utilizado para verificação da sua funcionalidade em modular a expressão do CSF1R, foi inserido na P. pastoris através do processo de eletroporação. Além disso, um vetor, o pEGFP-mCSF1R, foi construído para verificação da modulação da expressão do CSF1R através da fluorescência do gene da GFP (Green Fluorescent Protein) e citometria de fluxo. Na análise da citometria de fluxo foi observado o potencial da sequência inserida no vetor de expressão em silenciar o gene mCSF1R, mais especificamente, na proporção 3:1 (pLT-hU6-miR30-shRNA3:pEGFP-mCSF1R). No estudo também foi realizada a inserção dos vetores na P. pastoris, porém a confirmação foi realizada, apenas, pelo antibiótico marcador de seleção Zeocina, podendo ser complementada por PCR. Após as confirmações, novos estudos devem ser realizados para confirmação da modulação da expressão do mCSF1R e do perfil de macrófagos, a partir da utilização da levedura como vetor de entrega, bem como o potencial antitumoral do produto gerado.