Desenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para quantificação de gliotoxina em plasma humano para diagnóstico precoce da aspergilose

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2013
Autor(a) principal: Cerqueira, Letícia Bonâncio
Orientador(a): Pontarolo, Roberto, 1954-
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Plasma
Aspergilose
Teses
Farmácia
Cirurgia
Link de acesso: https://hdl.handle.net/1884/30024
Resumo: Orientador: Prof. Dr. Roberto Pontarolo
id UFPR_3260a72a4f2d80f9665787bcdaa33da8
oai_identifier_str oai:acervodigital.ufpr.br:1884/30024
network_acronym_str UFPR
network_name_str Repositório Institucional da UFPR
repository_id_str
spelling Campos, Francinete Ramos, 1972-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências FarmacêuticasPontarolo, Roberto, 1954-Cerqueira, Letícia Bonâncio2024-10-30T15:06:03Z2024-10-30T15:06:03Z2013https://hdl.handle.net/1884/30024Orientador: Prof. Dr. Roberto PontaroloCo-orientadora: Profa. Dra. Francinete Ramos CamposDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 22/02/2013Bibliografia: fls. 117-125Resumo: A aspergilose é uma infecção oportunista causada por fungos do gênero Aspergillus. É uma das principais complicações que acometem pacientes imunossuprimidos, podendo atingir índices de mortalidade de até 80%. O principal agente causador dessa infecção é o A. fumigatus, também considerada a principal espécie produtora de gliotoxina. Esta toxina é um produto do metabolismo secundário fúngico, apresenta comprovada toxicidade frente às células do sistema hematopoético e já foi detectada em soro de pacientes com diagnóstico positivo de aspergilose, podendo ser considerada um potencial biomarcador para o diagnóstico da doença. Atualmente o método de escolha para o diagnóstico da aspergilose é imunoenzimático, mas oferece apenas um indicativo da infecção, sendo necessários três resultados positivos consecutivos para que ela seja confirmada. A cromatografia liquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (CLAE-EM/EM) surge como uma nova alternativa para o diagnóstico, uma vez que é capaz de fornecer resultados com alta precisão e exatidão, e excelente sensibilidade. Nesse sentido, esse trabalho visa o desenvolvimento de um método por CLAE-EM/EM para detecção de gliotoxina em plasma de pacientes imunossuprimidos com suspeita de aspergilose. Para isso, alíquotas de plasma branco foram fortificadas com gliotoxina e submetidas ao processo de extração liquido-liquido, utilizando uma solução de éter etílico/acetato de etila (50:50, v/v), agitada em vórtex por 3 min. A fase orgânica foi recuperada e, em seguida, evaporada. O resíduo obtido foi resuspendido em uma solução de ACN/H2O (98:2, v/v) contendo 0,1% de ácido fórmico (AFO). As análises foram realizadas utilizando um cromatógrafo Agilent 1200 acoplado ao espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo API 3200 da ABSciex, provido de fonte de ionização por electrospray (ESI), operado no modo negativo de ionização. O experimento de Multiple Reaction Monitoring (MRM) foi utilizado para monitorar as transições dos íons de m/z 325'243 e m/z 325'261 referente à gliotoxina e m/z 301'179 e m/z 301'151 referentes ao padrão interno (quercetina). A separação cromatográfica foi obtida em uma coluna C18 XBridge (150 x 2,1 mm i.d; 5 ?m) e pré-coluna (XBridge C18, 10 x 2,1 mm i.d; 5 ?m). A fase móvel foi constituída de solução de NH4HCO2 1mM (A) e ACN contendo 5% de solução 1mM de NH4HCO2 (B) submetidos ao seguinte gradiente de eluição: t0-0,10 min.: 65%-0% A; t0,10-0,70 min.: 0% A; t0,7-0,71 min.: 0-65% A; t0,71-4,00 min.: 65% A. O tempo de corrida foi de 4 min. em um fluxo de 0,45 mL/min. O volume de injeção foi de 20 ?L. O método desenvolvido foi validado, considerado sensível, seletivo, linear (r>0,99) na faixa de 10 a 120 ng/mL, preciso, exato e livre de efeitos residuais e de matriz. O método foi aplicado com sucesso a 30 amostras reais de pacientes com suspeita de aspergilose, com 70% de concordância com os resultados obtidos pelo método de ELISA. O presente trabalho confirmou que é possível quantificar a gliotoxina em plasma através da técnica de CLAE-EM/EM e sua aplicação como diagnóstico é uma possibilidade real e muito promissora.Abstract: Aspergillosis is an opportunistic infection caused by fungi of the genus Aspergillus. It is a major complication of immunocompromised patients and its mortality can reach up to 80%. The main causative agent of this infection is A. fumigatus, which is also the main gliotoxin-producing species. This toxin is a product of fungal secondary metabolism and has been shown toxicity against hematopoietic system cells. It has already been detected in sera samples of patients with positive diagnosis of aspergillosis and, for this reason, can be considered as a potential biomarker for diagnosis of this disease. Imunoenzimatic assay is the currently gold standard method for diagnosing Aspergillosis but it only provides an indicative of infection, requiring three consecutive positive results to confirm the diagnosis. The high performance liquid chromatography coupled tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) appears as a new alternative for the diagnosis of aspergillosis, since it is capable to provide high precision and accuracy results with excellent sensitivity. On this way, this work aims to develop an HPLC-MS/MS method for the detection of gliotoxin in plasma of patients with suspected infection by Aspergillus. For this, aliquots of blank plasma were spiked with gliotoxin and submitted to liquid-liquid extraction, using a solution of ethyl ether / ethyl acetate (1:1, v /v). The organic phase was recovered and then evaporated. The residue obtained was resuspended in a solution of ACN/H2O (98:2, v /v) with 1 mM of NH4HCO2. Analyses were performed using an Agilent 1200 liquid chromatograph coupled to mass spectrometer API 3200 triple quadrupole ABSciex provided with electrospray ionization source (ESI) operated in the negative ion mode. The experiment Multiple Reaction Monitoring (MRM) was used to monitor the transition of the ions of m/z 325' 243 and m/z 325 ' 261 corresponding to gliotoxin and m/z 301 ' 179 and m/z 301' 151 related to internal standard (quercetin). The chromatographic separation was obtained in a XBridge C18 column (150 x 2.1 mm id; 5 mm) and guard column (XBridge C18, 10 x 2.1 mm id, 5 mm). The mobile phase was composed of 1 mM NH4HCO2 solution (A) and MeCN containing 5% NH4HCO2 1mM (B) eluted by the following gradient: t0-0, 10 min: 65% -0% A; t0 10 -0.70 min: 0% A; t0 0.7 to 0, 71 min: 0-65% A; t0 0.71 to 4, 00 min: 65% A. The run time was 4 min at a flow rate of 0.45 mL / min. The injection volume was 20 ?L. The method was fully validated, being considered linear (r> 0.99) in the range of 10 to 120 ng/ mL, sensitive, selective, precise, accurate and free of matrix and carry over effects. The method was successfully applied to real samples from 30 patients with suspected aspergillosis, reaching 70% of agreement with ELISA results. This study confirmed that it is possible to quantify gliotoxin in plasma using the technique of HPLC-MS/MS and the present method can be potentially applied for aspergillosis diagnosis.125f. : il. [algumas color.], grafs., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalPlasmaAspergiloseTesesFarmáciaCirurgiaDesenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para quantificação de gliotoxina em plasma humano para diagnóstico precoce da aspergiloseinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - LETICIA BONANCIO CERQUEIRA.pdfapplication/pdf2147577https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30024/1/R%20-%20D%20-%20LETICIA%20BONANCIO%20CERQUEIRA.pdfabd17867b1ded9341c18c7df3f639cd0MD51open accessTEXTR - D - LETICIA BONANCIO CERQUEIRA.pdf.txtExtracted Texttext/plain218921https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30024/2/R%20-%20D%20-%20LETICIA%20BONANCIO%20CERQUEIRA.pdf.txte806b1cb733b8134f673c51cf4372edcMD52open accessTHUMBNAILR - D - LETICIA BONANCIO CERQUEIRA.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1440https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30024/3/R%20-%20D%20-%20LETICIA%20BONANCIO%20CERQUEIRA.pdf.jpg7e50293794cb85e2785990ac98459d0eMD53open access1884/300242024-10-30 12:06:03.644open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/30024Repositório InstitucionalPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestinformacaodigital@ufpr.bropendoar:3082024-10-30T15:06:03Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
dc.title.pt_BR.fl_str_mv Desenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para quantificação de gliotoxina em plasma humano para diagnóstico precoce da aspergilose
title Desenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para quantificação de gliotoxina em plasma humano para diagnóstico precoce da aspergilose
spellingShingle Desenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para quantificação de gliotoxina em plasma humano para diagnóstico precoce da aspergilose
Cerqueira, Letícia Bonâncio
Plasma
Aspergilose
Teses
Farmácia
Cirurgia
title_short Desenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para quantificação de gliotoxina em plasma humano para diagnóstico precoce da aspergilose
title_full Desenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para quantificação de gliotoxina em plasma humano para diagnóstico precoce da aspergilose
title_fullStr Desenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para quantificação de gliotoxina em plasma humano para diagnóstico precoce da aspergilose
title_full_unstemmed Desenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para quantificação de gliotoxina em plasma humano para diagnóstico precoce da aspergilose
title_sort Desenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para quantificação de gliotoxina em plasma humano para diagnóstico precoce da aspergilose
author Cerqueira, Letícia Bonâncio
author_facet Cerqueira, Letícia Bonâncio
author_role author
dc.contributor.other.pt_BR.fl_str_mv Campos, Francinete Ramos, 1972-
Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
dc.contributor.advisor1.fl_str_mv Pontarolo, Roberto, 1954-
dc.contributor.author.fl_str_mv Cerqueira, Letícia Bonâncio
contributor_str_mv Pontarolo, Roberto, 1954-
dc.subject.por.fl_str_mv Plasma
Aspergilose
Teses
Farmácia
Cirurgia
topic Plasma
Aspergilose
Teses
Farmácia
Cirurgia
description Orientador: Prof. Dr. Roberto Pontarolo
publishDate 2013
dc.date.issued.fl_str_mv 2013
dc.date.accessioned.fl_str_mv 2024-10-30T15:06:03Z
dc.date.available.fl_str_mv 2024-10-30T15:06:03Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv https://hdl.handle.net/1884/30024
url https://hdl.handle.net/1884/30024
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.pt_BR.fl_str_mv Disponível em formato digital
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv 125f. : il. [algumas color.], grafs., tabs.
application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Institucional da UFPR
instname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)
instacron:UFPR
instname_str Universidade Federal do Paraná (UFPR)
instacron_str UFPR
institution UFPR
reponame_str Repositório Institucional da UFPR
collection Repositório Institucional da UFPR
bitstream.url.fl_str_mv https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30024/1/R%20-%20D%20-%20LETICIA%20BONANCIO%20CERQUEIRA.pdf
https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30024/2/R%20-%20D%20-%20LETICIA%20BONANCIO%20CERQUEIRA.pdf.txt
https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30024/3/R%20-%20D%20-%20LETICIA%20BONANCIO%20CERQUEIRA.pdf.jpg
bitstream.checksum.fl_str_mv abd17867b1ded9341c18c7df3f639cd0
e806b1cb733b8134f673c51cf4372edc
7e50293794cb85e2785990ac98459d0e
bitstream.checksumAlgorithm.fl_str_mv MD5
MD5
MD5
repository.name.fl_str_mv Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)
repository.mail.fl_str_mv informacaodigital@ufpr.br
_version_ 1847526214286180352

Registros relacionados