Edição genômica de ctsz, nccrp1 e arg2 mediada por CRISPR/Cas9 para o estudo do comportamento de macrófagos em zebrafish (Danio rerio)

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2024
Autor(a) principal: Bastos, Thais Sibioni Berti
Orientador(a): Braga, Tárcio Teodoro, 1985-
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Macrofagos
Inflamação
Paulistinha (Peixe)
Animais transgenicos
Microbiologia
Link de acesso: https://hdl.handle.net/1884/96470
Resumo: Orientador: Prof. Dr. Tárcio T. Braga
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spelling Rocha, Wanderson Duarte daUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e PatologiaBraga, Tárcio Teodoro, 1985-Bastos, Thais Sibioni Berti2025-05-09T21:26:37Z2025-05-09T21:26:37Z2024https://hdl.handle.net/1884/96470Orientador: Prof. Dr. Tárcio T. BragaCoorientador: Prof. Dr. Wanderson D. da RochaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 03/09/2024Inclui referênciasResumo: A inflamação é um processo fisiológico necessário para a manutenção da homeostasia do organismo e os macrófagos são células responsáveis por este processo e pela defesa frente a microrganismos. Seus diferentes fenótipos atuam ao longo do processo inflamatório, desde sua instauração até a completa resolução. Sabe-se que a resposta anti-inflamatória é orquestrada por macrófagos comumente chamados de M2, porém, uma resposta desbalanceada destas células pode causar quadros graves de doença crônica e fibrose. Nosso objetivo foi avaliar in vivo os genes candidatos ctsz, nccrpl e arg2 como possíveis marcadores de macrófagos semelhantes a M2. Para isso, aplicamos a técnica de CRISPR/Cas9 para gerar grandes deleções nos genes utilizando o modelo animal zebrafish. Nestes animais CRISPants, geramos o processo inflamatório estéril a partir da transecção da nadadeira caudal para avaliar a dinâmica de infiltração de neutrófilos e macrófagos. Acompanhamos os animais por até 48 horas pós injúria (hpi) para avaliar a regeneração, a migração e polarização dos macrófagos. As deleções dos genes foram alcançadas com eficiência de 50,61%, 67,64% e 60% para os genes ctsz, nccrpl e arg2, respectivamente. Nos animais ctsz e arg2 mutantes observamos um aumento na regeneração na segunda metade do processo, de 24 a 48 hpi. Animais deficientes em nccrpl não apresentaram diferenças no processo regenerativo. Ao analisar a quantidade e a polarização dos macrófagos, animais ctsz mutantes apresentaram uma redução no número de macrófagos totais recrutados em 48 horas, quando comparados ao grupo controle (p = 0.0253). Por outro lado, o número de macrófagos pró-inflamatórios foi maior em ctsz mutantes do que no grupo controle (p = 0.0088). Nenhuma alteração no número de neutrófilos foi observada em nenhum dos animais mutantes. Os resultados obtidos sugerem que o gene da ctsz pode estar envolvido no processo de polarização para macrófagos semelhantes a M2, já que esses animais tiveram um aumento em tempos iniciais de macrófagos positivos para TNFa, uma citocina expressa por macrófagos semelhantes a M1. Uma vez que a deleção do gene ctsz perturbou a polarização destas células para o fenótipo pró-resolutivo esperado, macrófagos pró-inflamatórios permaneceram no local da lesão e induziram uma regeneração de forma mais acentuada. Portanto, sugerimos que o gene ctsz pode ser um candidato promissor para ser utilizado como marcador de macrófagos semelhantes a M2 em zebrafish.Abstract: Inflammation is a physiological process necessary for maintaining the body's homeostasis. Macrophages are the cells responsible for maintaining homeostasis and defending against microorganisms and their different phenotypes act throughout the inflammatory process, from its onset to its complete resolution. It is known that the anti inflammatory response is orchestrated by macrophages commonly known as M2, but an unbalanced response from these cells can cause severe chronic disease and fibrosis. Therefore, our aim was to evaluate in vivo the candidate genes ctsz, nccrpl and arg2 as possible markers of M2-like macrophages. To do this, we applied the CRISPR/Cas9 technique to generate large gene deletions in the zebrafish animal model. In these CRISPants animals, we generated the sterile inflammatory process by transecting the caudal fin to assess the dynamics of neutrophil and macrophage infiltration. We monitored the animals for up to 48 hours post-injury to assess macrophage regeneration, migration and polarization. Gene deletions were achieved with efficiencies of 50.61%, 67.64% and 60% for the ctsz, nccrpl and arg2 genes, respectively. In the ctsz and arg2 mutant animals, we observed an increase in regeneration in the second half of the process, 24 to 48 hours after injury. Animals deficient in nccrpl showed no differences in the regenerative process. When analyzing the quantity and polarization of macrophages, ctsz mutant animals showed a reduction in the number of total macrophages recruited within 48 hours, when compared to the control group (p = 0.0253). On the other hand, the number of pro-inflammatory macrophages was higher in ctsz mutants than in the control group (p = 0.0088). No change in the number of neutrophils was observed in any of the mutant animals. The results obtained suggest that the ctsz gene may be involved in the polarization process of M2-like macrophages, since these animals had an increase in early times of macrophages positive for TNFa, a cytokine expressed by M1 -like macrophages. Since the deletion of the ctsz gene disrupted the polarization of these cells towards the expected pro-resolving phenotype, pro-inflammatory macrophages remained at the site of injury and induced regeneration to a greater extent. Therefore, we suggest that the ctsz gene may be a promising candidate for use as a marker of M2-like macrophages in zebrafish.1 recurso online : PDF.application/pdfMacrofagosInflamaçãoPaulistinha (Peixe)Animais transgenicosMicrobiologiaEdição genômica de ctsz, nccrp1 e arg2 mediada por CRISPR/Cas9 para o estudo do comportamento de macrófagos em zebrafish (Danio rerio)info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - THAIS SIBIONI BERTI BASTOS.pdfapplication/pdf31917048https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/96470/1/R%20-%20T%20-%20THAIS%20SIBIONI%20BERTI%20BASTOS.pdf9d2e4b13ffbc849059a0b469d95788f8MD51open access1884/964702025-05-09 18:26:37.747open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/96470Repositório InstitucionalPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestinformacaodigital@ufpr.bropendoar:3082025-05-09T21:26:37Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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