Caracterização bioquímica e funcional da deubiquitinase USP2a

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2016
Autor(a) principal: Ribeiro, Caroline Fidalgo
Orientador(a): Zanata, Silvio Marques
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Enzimas
Proteases Específicas de Ubiquitina
Neoplasias da próstata
Link de acesso: http://hdl.handle.net/1884/45421
Resumo: Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata
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spelling Ribeiro, Caroline FidalgoUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia BásicaZanata, Silvio Marques2017-02-15T19:09:18Z2017-02-15T19:09:18Z2016http://hdl.handle.net/1884/45421Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques ZanataTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 29/08/2016Inclui referências : f. 81-84Área de concentração: PatologiaResumo: USP2a é uma importante enzima deubiquitinase (DUB) capaz de remover a ubiquitina de diferentes substratos, como da enzima FASN e do receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR). Em tumores de próstata observa-se uma correlação positiva entre a expressão de USP2a e a tumorigênese, caracterizando-a como uma proteína oncogênica. Essa característica da DUB está principalmente relacionada com sua função estabilizadora da enzima FASN, responsável pela síntese de ácidos graxos na célula. A USP2a também resgata o EGFR da degradação, mantendo seus níveis celulares elevados. Sabe-se que o direcionamento de proteínas da membrana plasmática para a via do corpo multivesicular requer a ação dos complexos proteicos ESCRTs. Um deles, o ESCRT-0, possui duas subunidades: Hrs, responsável por direcionar o complexo aos endossomos precoces, e a subunidade STAM, capaz de interagir com diferentes DUBs. Sabe-se que a USP2a co-localiza com EEA1, um marcador de endossomos precoces, então decidiu-se analisar se a USP2a interage também com STAM, e identificar o sítio dessa interação. Para isso, linhagens celulares normais e tumorais de próstata foram modificadas para expressar permanentemente a forma selvagem e o mutante cataliticamente inativo de USP2a, e também foram silenciadas para a expressão de STAM. As sequências de STAM, de sua região SH3 e do mutante STAM SH3 foram clonadas, com o intuito de se obter plasmídeos de superexpressão para esses construtos. A primeira evidência de interação entre USP2a e STAM foi observada em ensaio de co-imunoprecipitação com células tumorais de próstata superexpressando USP2a, mas esse resultado ainda não foi totalmente confirmado. A região de STAM que pode contribuir para essa interação não foi identificada devido a baixos níveis de expressão dos construtos. Uma relação indireta entre USP2a e STAM foi observada, com o aumento da ubiquitinação de STAM com a superexpressão da forma selvagem da enzima em células de próstata, sem alterar os níveis celulares da proteína. Observou-se também que STAM é capaz de modular a reciclagem de EGFR em linhagens celulares de próstata, uma vez que seu silenciamento aumenta a taxa de degradação de EGFR. Analisou-se também o efeito fenotípico da deleção do gene fasn em camundongos com tumores de próstata induzidos pela perda de Pten. Verificou-se que a inibição genética de FASN reduz a incidência de formas agressivas de tumores de próstata nos animais. Os resultados obtidos sugerem que FASN, assim como USP2a, pode ser um importante alvo farmacológico para o tratamento de tumores de próstata. Palavras-chave: USP2a. ESCRT-0. STAM. EGFR. FASN.Abstract: USP2a is an important deubiquitinating enzyme (DUB) capable of removing ubiquitin from different substrate proteins, like FASN and epidermal growth factor receptor (EGFR). In prostate tumors there is a positive correlation between USP2a expression level and tumorigenesis, which makes it an oncogenic protein. This characteristic is mainly related with its ability to stabilize FASN, the enzyme that synthesizes fatty acids in cells. USP2a also rescues EGFR from lysosomal degradation, keeping its cellular levels raised. orting of plasma membrane proteins into multivesicular body pathway requires the ESCRTs complexes. One of these, the ESCRT-0, has two subunits: the subunit Hrs, that is responsible for targeting the complex to early endosome, and the subunit STAM, which interacts with different DUBs. -localizes with EEA1, a marker of early endosomes, so we decided to analyze if USP2a also interacts with STAM, whether this interaction is needed to taking USP2a to early endosome and identify the protein site required for this interaction. For this, normal and tumoral prostate cell lines were modified to permanently overexpress USP2a wild type and its catalytically inactive mutant, these cell lines also had the STAM expression knocked down. Molecular cloning of STAM, its SH3 region and a mutant lacking SH3, all tagged with GFP, were performed in order to obtain plasmids for overexpression of this constructs. The first sign of interaction between USP2a and STAM was observed with a co-immunoprecipitation assay in prostate tumoral cells overexpressing USP2a, but it was not fully confirmed. The region of STAM constructs. Indirect relationship between USP2a and STAM was observed, since overexpression of wild type USP2a is related with enhanced ubiquitination of STAM in prostate cell lines, even though the protein level remains the same. STAM is also capable of affect EGFR recycling in prostate cell lines, since STAM knocked down cells shown enhanced degradation of EGFR. It was also analyzed the effect of fasn gene deletion on Pten loss driven prostate tumors. The genetic ablation of FASN reduced the incidence of aggressive prostate tumors in mice, suggesting that FASN, as well as USP2a, could be an important pharmacological target for treatment of prostate cancer. Key words: USP2a. ESCRT-0. STAM. EGFR. FASN.84f : il., algumas color., grafs., tabs.application/pdfDisponível também em formato digitalEnzimasProteases Específicas de UbiquitinaNeoplasias da próstataCaracterização bioquímica e funcional da deubiquitinase USP2ainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - CAROLINE FIDALGO RIBEIRO.pdfapplication/pdf3374445https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/45421/1/R%20-%20T%20-%20CAROLINE%20FIDALGO%20RIBEIRO.pdf14c0f62ada6eccff08a93f4bb5ee147aMD51open access1884/454212017-02-15 17:09:18.329open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/45421Repositório InstitucionalPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestinformacaodigital@ufpr.bropendoar:3082017-02-15T19:09:18Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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