Funções da proteína Pso9/Mec3 no controle do ciclo celular e reparação de DNA em Saccharomyces cerevisiae

• Ano de defesa: 2006
• Autor(a) principal: Cardone, Jacqueline Moraes
• Orientador(a): Henriques, João Antonio Pêgas
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Saccharomyces cerevisiae; Mutagenese; Reparação do DNA; Ciclo celular; Pso9-1; Gene mec3
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/8332

A manutenção da estabilidade do material hereditário das células requer fidelidade na replicação do DNA, precisão na segregação dos cromossomos e a capacidade de evitar mutações herdáveis, causadas por injúrias espontâneas e induzidas no genoma. Para enfrentar estes desafios, as células possuem processos evolutivamente conservados, incluindo reparação do DNA e mecanismos de checkpoint. Falhas no cumprimento destes mecanismos podem resultar em morte celular, no acúmulo de mutações herdáveis e na indução de instabilidade genômica, a qual é uma característica predominante de células tumorais. Em Saccharomyces cerevisiae, a visão mais recente dos estágios iniciais da resposta de checkpoint indica que dois complexos de proteínas, Mec1-Ddc2 e Rad17- Mec3-Ddc1, são recrutados à região de lesão no DNA. Rad17p, Mec3p, e Ddc1p (os homólogos humanos são Rad1, Hus1, e Rad9, respectivamente) formam um complexo heterotrimérico estruturalmente relacionado ao antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), o fator de processividade das DNA polimerases δ e ε. Recentemente, identificamos um alelo mutante de MEC3 – pso9-1 – o qual é fortemente sensível a vários agentes indutores de danos no DNA e apresenta baixa mutabilidade induzida. Para prosseguir nas investigações dos efeitos da proteína mutante Pso9-1, a seqüência completa do alelo mutante foi determinada. A comparação das seqüências obtidas com a seqüência tipo-selvagem depositada nos bancos de dados revelou a deleção de um único nucleotídeo, na posição 802 (802delA), a qual leva a uma forma truncada de Pso9p. O alelo mutante pso9-1[802delA] codifica, um polipeptídeo de 276 aminoácidos, no qual os últimos nove aminoácidos estão fora da fase leitura apropriada e seu domínio carboxi-terminal, drasticamente diminuído. Esta mutação afetou as propriedades de ligação de Pso9-1p, impedindo as interações com seus parceiros de complexo Rad17p e Ddc1p. Ensaios adicionais de interação empregando construções de mec3 que não continham os últimos 25 e 75 aminoácidos do domínio carboxiterminal também não foram capazes de manter interações estáveis. Além disso, a linhagem mutante pso9-1 perdeu a capacidade de detectar danos no DNA, uma vez que dava continuidade no ciclo-celular, após tratamento com 8-metoxipsoraleno fotoativado. Uma vez analisada a reposta a danos no DNA de mutantes deficientes no componente de PCNA-like, Pso9p/Mec3p, em combinação à inativação de subunidades de DNA polimerases replicativas (Pols α, δ and ε), foi encontrada uma interação aditiva entre PSO9/MEC3 e POL32, o qual codifica a terceira subunidade da DNA polimerase δ. A hipersensibilidade de pol32Δ a 8-MOP fotoativado, revelada por estas análises genéticas, sugeriu fortemente a participação ainda não descrita de uma polimerase replicativa na reparação de pontes intercadeias. Esta hipótese foi confirmada, já que o mutante pol32Δ também se mostrou extremamente deficiente em ligar extremidades de DNA não-coesivas, particularmente em casos de extremidades protuberantes 5’, sugerindo um papel para a DNA polimerase δ em recombinação não-homóloga (NHEJ). A coleção de dados apresentada neste trabalho reafirma a importância de proteínas como Pso9p/Mec3p que iniciam a sinalização de anormalidades no DNA. Além disso, amplia a rede de proteínas que responde a danos do tipo pontes intercadeias, mostrando que uma proteína em particular, como visto para Pol32p, pode ter tarefas adicionais como mecanismo de segurança, a fim de garantir a estabilidade genômica.