Avaliação da termoestabilidade, atividade e resistência a ambientes ácidos de uma enzima de interesse biotecnológico via dinâmica molecular

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Silva, Sérgio Ruschi Bergamachi
• Orientador(a): Vieira, Davi Serradella
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Programa de Pós-Graduação: PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
• País: Brasil
• Palavras-chave em Português: Xilanase; Dinâmica molecular; Mutantes; Enzimas multidomínio; Desenvolvimento biotecnológico
• Área do conhecimento CNPq: CNPQ::CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::QUIMICA
• Link de acesso: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/26207

A produção de etanol lignocelulósico através da rota enzimática tem ganhado espaço dentre os processos industriais a fim de substituir o tratamento ácido tradicional. As xilanases (E.C. 3.2.1.8) constituem uma classe de enzimas presentes no coquetel enzimático utilizado para esse fim e possuem grande interesse industrial/comercial devido sua alta versatilidade em diversos processos já conhecidos. Nesse contexto, algumas propriedades de interesse biotecnológico de uma xilanase da família GH11 foram avaliadas a partir de análises das simulações de dinâmica molecular (DM). Em um primeiro estudo, foram realizadas simulações por DM de uma xilanase produzida pela bactéria Bacillus subtilis (XynA_WT) e um mutante quádruplo (Gln7His, Gly13Arg, Ser22Pro e Ser179Cys) que apresenta uma temperatura catalítica ótima 20 ºC acima da XynA_WT. Os resultados da DM sugerem possíveis estratégias para engenharia de xilanases da família GH11 para produzir enzimas termoestáveis. As mutações em regiões que apresentam pouca flexibilidade deveriam preservar a rigidez, mas a substituição delas pode ser escolhida para afetar favoravelmente outras propriedades, como a solvatação ou interações hidrofóbicas. Os dados não explicam apenas o efeito de termoestabilidade de uma xilanase de GH11 observado em experimentos anteriores de evolução direta, mas também fornece informações para o planejamento de outros mutantes GH11 termoestáveis através do desenho racional. Em um segundo estudo, o alvo foi uma quimera formada entre um domínio xilanolítico (XynA) e uma proteína receptora de xilose (XBP) que apresentou uma eficiência catalítica experimental quase 3,5 vezes maior que a mesma xilanase não-quimerizada. Os fatores responsáveis por essa discrepância foram entendidos através de simulações DM. Os resultados sugeriram a formação e estabilização de uma interface proteínaproteína entre os dois domínios na presença e na ausência de xilose no sítio ativo da XBP. Valores de energia potencial de interação (IPE) em função do tempo mostram que existe uma maior estabilização nas interações dessa interface para estrutura com xilose em comparação com a estrutura sem xilose. Parâmetros estruturais como a flexibilidade e volume do sítio ativo também foram avaliados. Em geral, os resultados sugerem que a quimera apresenta uma estrutura mais rígida em comparação com xilanase isolada e, em particular, a região do polegar, que controla a exposição do sítio ativo, demonstra uma redução significativa na flexibilidade. Por fim, simulações DM em diferentes pHs foram feitas com o intuito de entender a queda drástica na atividade catalítica da xilanase (isolada e na forma de quimera) quando presente em ambientes ácidos, e dessa forma, agregar informações para aumentar sua resistência nessas condições. Dados de mudanças do estado de protonação, distância abre-fecha do sítio ativo, raio de giro e superfície acessível ao solvente ajudaram a entender esse fenômeno e fornecem indicativos para futuras pesquisas nesse sentido. A tese reforça a capacidade descritiva, e posteriormente preditiva, das simulações DM no desenvolvimento biotecnológico de xilanases GH11.