Avaliação de potência de toxina botulínica tipo a por ensaios biológicos e método por cromatografia líquida em fase reversa
Ano de defesa: | 2015 |
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Universidade Federal de Santa Maria
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Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
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Farmacologia
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Resumo: | Botulinum toxin type A (BTTA) is a polypeptide with 1296 amino acids and its used in some pathologies like hyperhidrosis and migraine, but the cosmetic area is the most important application. BTTA is produced from broth-culture synthesized by the Clostridium botulinum as a single peptide with 150 kDa. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was developed and validated for the assessment of botulinum toxin type A in biopharmaceutical formulations. A RP-LC method was carried out on a Zorbax 300 SB C18 column (150 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 45 ºC. The mobile phase A consisted of 0.05 M sodium sulphate buffer, pH 2.8, and the mobile phase B was acetonitrile, run isocratically at flow rate 0.3 mL/min. Cromatographic separation was obtained with retention time of 11.4 min, and was linear over the concentration range of 0.2-100 IU/mL (r2 = 0.9999) with photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The limits of detection and quantitation were 0.04 and 0.16 IU/mL, respectively. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the accuracy was 100.31% with bias lower than 0.80%. The method was correlated with in vivo and in vitro bioassays. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of related proteins and higher molecular weight forms showed significant differences (p <0.05) compared to intact molecule. The validated methods were applied for the determination of BTTA in biopharmaceutical-derived products, giving mean values of the estimated content/potencies 1.16% lower compared to the in vivo bioassay. It is concluded that represents a contribution to establish new alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure efficacy of the biotechnology-derived product. |
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2015-05-272015-05-272015-02-26FREITAS, Guilherme Weber de. POTENCY EVALUATION OF BOTULINUM TOXIN TYPE A BY BIOASSAYS AND REVERSE-PHASE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD. 2015. 65 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, 2015.http://repositorio.ufsm.br/handle/1/6003Botulinum toxin type A (BTTA) is a polypeptide with 1296 amino acids and its used in some pathologies like hyperhidrosis and migraine, but the cosmetic area is the most important application. BTTA is produced from broth-culture synthesized by the Clostridium botulinum as a single peptide with 150 kDa. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was developed and validated for the assessment of botulinum toxin type A in biopharmaceutical formulations. A RP-LC method was carried out on a Zorbax 300 SB C18 column (150 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 45 ºC. The mobile phase A consisted of 0.05 M sodium sulphate buffer, pH 2.8, and the mobile phase B was acetonitrile, run isocratically at flow rate 0.3 mL/min. Cromatographic separation was obtained with retention time of 11.4 min, and was linear over the concentration range of 0.2-100 IU/mL (r2 = 0.9999) with photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The limits of detection and quantitation were 0.04 and 0.16 IU/mL, respectively. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the accuracy was 100.31% with bias lower than 0.80%. The method was correlated with in vivo and in vitro bioassays. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of related proteins and higher molecular weight forms showed significant differences (p <0.05) compared to intact molecule. The validated methods were applied for the determination of BTTA in biopharmaceutical-derived products, giving mean values of the estimated content/potencies 1.16% lower compared to the in vivo bioassay. It is concluded that represents a contribution to establish new alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure efficacy of the biotechnology-derived product.A toxina botulínica tipo A (BTTA) é um polipeptídio constituído de 1296 aminoácidos e é recomendada para patologias, como hiperhidrose e enxaqueca, mas é especialmente usada como cosmético. A toxina botulínica é produzida através do processo de fermentação bacteriana e após sucessivas etapas de purificação resulta em uma proteína com 150 kDa responsável pelo seu efeito biológico. No presente trabalho foi desenvolvido e validado método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) para a avaliação de potência de BTTA em formulações de produtos biofarmacêuticos. No método foi utilizada coluna Zorbax 300 SB C18 (150 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 45 ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato de sódio 0,05 M, pH 2,8, e a fase móvel B por acetonitrila, eluídas em vazão isocrática de 0,3 mL/min. O método utilizou detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida em 11,4 min, sendo linear na faixa de concentração de 0,2-100 UI/mL (r2 = 0,9999). Os limites de detecção e quantificação foram 0,04 e 0,16 UI/mL, respectivamente. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,31 com bias inferior a 0,80. O método validado foi correlacionado com bioensaios in vivo e in vitro. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p <0,05). O método proposto foi aplicado para avaliação da potência de BTTA em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com o bioensaio in vivo, observando-se diferença das médias de teor/potência de 1,16% inferior para o método cromatográfico. Contribuíu-se assim para estabelecer procedimentos que aprimoram a caracterização ou o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia do produto biotecnológico.application/pdfporUniversidade Federal de Santa MariaPrograma de Pós-Graduação em Ciências FarmacêuticasUFSMBRFarmacologiaToxina botulínica tipo A (BTTA)Cromatografia líquida em fase reversaBioensaio de DL50Cultura celular T47DValidaçãoCorrelaçãoBotulinum toxin type AReversed-phase liquid chromatographyLD50 mice bioassayCell culture T47DValidationCorrelationCNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::FARMACOLOGIAAvaliação de potência de toxina botulínica tipo a por ensaios biológicos e método por cromatografia líquida em fase reversaPotency evaluation of botulinum toxin type a by bioassays and reverse-phase liquid chromatography methodinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisDalmora, Sergio Luizhttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780857Y5Paula, Gizelli Moiano dehttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4253599P7Horner, Rosmarihttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4707613Z5http://lattes.cnpq.br/1710447631115944Freitas, Guilherme Weber de201000000000400500300500300c5c3d2e7-af0f-4f36-b006-046daf37340a731952b4-4177-4c6b-a838-e14e484ed71dfabc0cad-32be-4676-9258-f8ca938906129b9181b8-425f-4fcc-867c-dd8dca30a2ddinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações do UFSMinstname:Universidade Federal de Santa Maria (UFSM)instacron:UFSMORIGINALFREITAS, GUILHERME WEBER DE.pdfapplication/pdf505332http://repositorio.ufsm.br/bitstream/1/6003/1/FREITAS%2c%20GUILHERME%20WEBER%20DE.pdfeb5479ba3992f055d074ffd897a44544MD51TEXTFREITAS, GUILHERME WEBER DE.pdf.txtFREITAS, GUILHERME WEBER DE.pdf.txtExtracted texttext/plain87882http://repositorio.ufsm.br/bitstream/1/6003/2/FREITAS%2c%20GUILHERME%20WEBER%20DE.pdf.txt69a0134372bffff75bb608bf2da4a9dfMD52THUMBNAILFREITAS, GUILHERME WEBER DE.pdf.jpgFREITAS, GUILHERME WEBER DE.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg4837http://repositorio.ufsm.br/bitstream/1/6003/3/FREITAS%2c%20GUILHERME%20WEBER%20DE.pdf.jpg3bc536e921bfe8252b103b9d550ea0e0MD531/60032022-03-15 15:46:42.32oai:repositorio.ufsm.br:1/6003Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttps://repositorio.ufsm.br/ONGhttps://repositorio.ufsm.br/oai/requestatendimento.sib@ufsm.br||tedebc@gmail.comopendoar:2022-03-15T18:46:42Biblioteca Digital de Teses e Dissertações do UFSM - Universidade Federal de Santa Maria (UFSM)false |
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