Extração de DNA para a análise da amelogenina em amostras fixadas em formalina, incluídas em parafina e arquivadas por 1 e 5 anos no Departamento de Patologia da Universidade Federal de São Paulo

• Ano de defesa: 2011
• Autor(a) principal: Funabashi, Karina Silva [UNIFESP]
• Orientador(a): Iwamura, Edna Sadayo Miazato [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• dARK ID: ark:/48912/001300002061m
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: Extração de DNA; Parafina; Amelogenina
• Palavras-chave em Inglês: Paraffin; DNA extraction
• Link de acesso: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9627

Tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina permitem investigações retrospectivas valiosas para estudos moleculares, especialmente em estudos genéticos, nos casos em que o DNA não se encontra disponível em amostras congeladas e/ou frescas. Entretanto, de acordo com alguns autores, é difícil obter um DNA de boa qualidade, uma vez que o processo de fixação resulta na fragmentação dos ácidos nucleicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o DNA extraído de tecidos parafinados, após 1 e 5 anos de armazenamento, através de 3 métodos de extração. Para isso, foram utilizados o gene da β-actina (136pb), a fim de detectar a viabilidade e fragmentação do DNA extraído, e da amelogenina (X: 212pb e Y: 218pb) para diferenciação do sexo do indivíduo e viabilidade na utilização de primers com comprimento maior. O estudo envolveu 12 casos de autópsia recentes, onde amostras normais de fígado (n=10), baço (n=10) e cérebro (n=10) foram coletadas em duplicata, de modo que um grupo seguiu para o processo de fixação e inclusão em parafina, e outro grupo seguiu para o congelamento. Além disso, foram utilizados os mesmos tipos de tecidos, normais (n=10 cada), oriundos de 13 casos de autópsia armazenados por 1 ano e 15 casos armazenados por 5 anos. Após a remoção da parafina, as amostras foram submetidas às extrações com kit comercial (QIAGEN QIAamp Mini), Salting-Out e fenol-clorofórmio. O DNA extraído foi quantificado no aparelho Nanodrop® e ajustado para PCR (10ng/μl). Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose a 1%. As amostras de baço e fígado apresentaram maior rendimento em relação à extração de DNA quando comparado ao cérebro, em todos os tempos. Todas as amostras arquivadas apresentaram boas condições de extração de DNA, porém deve-se levar em consideração o processo de fixação e inclusão dos tecidos, que podem comprometer a qualidade do DNA. A extração pelo fenol rendeu maior quantidade de DNA e grau de pureza em relação aos outros métodos estudados, porém o kit comercial mostrou melhores resultados quanto à amplificação do DNA obtido. Houve amplificação do gene da amelogenina em todas as amostras utilizadas, porém recomenda-se a utilização de primers menores para uma completa análise do fragmento a ser estudado.