Estudo do mecanismo molecular de transfecção mediada por ultrassom

• Ano de defesa: 2010
• Autor(a) principal: De Paula, Daisy Maria Bentes [UNIFESP]
• Orientador(a): Han, Sang Won [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• dARK ID: ark:/48912/001300001wfm3
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: Captação de DNA plasmideal; Clathrin; Clatrina; Endocitose; Influxo de cálcio; Ultrassom; Transfecção
• Palavras-chave em Inglês: Calcium influx; Endocytosis; Plasmid uptake; Ultrasonics; Transfection
• Link de acesso: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9564

O ultrassom (US) vem sendo amplamente utilizado para melhorar a eficiência de transfecção de vetores não-virais. No entanto, o mecanismo pelo qual o US promove a entrega de DNA nas células ainda é pouco entendido. Este fenômeno é normalmente atribuído a sonoporação. Porém, com base em experimentos anteriores realizados em nosso laboratório, suspeitamos que outro mecanismo esteja envolvido no processo de captação de DNA. Para estudar o mecanismo de entrega, um vetor plasmideal expressando EGFP (pEGFP-N3, 4,7 kb) foi utilizado para transfectar células NIH3T3 com um aparelho de US terapêutico sem a adição de microbolhas. Em condições de insonação de 2 W/cm2, duty cycle de 20% por 30s o US promoveu cerca de 40% de eficiência de transfecção, mas com 1 W/cm2 resultou em níveis muito baixos de transfecção. Fixados esses parâmetros, também foi avaliada a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o aumento da concentração intracelular de cálcio ([Ca2+]i) e as alterações no potencial de membrana através de microscopia confocal. A produção de ROS foi aumentada durante a insonação, sendo interrompida logo que o US foi desligado. A [Ca2+]i também foi aumentada durante a exposição ao US, mas seus níveis não retornaram ao basal durante os 3 minutos de observação. Porém, 1 W/cm2 não foi suficiente para mobilizar o cálcio durante a insonação, e o influxo de cálcio teve início apenas 12 segundos após o término do US. Quando expostas ao US, as células também apresentaram mudanças no potencial de membrana atingindo um estado de hiperpolarização, retornando ao estado normal logo que o US foi desligado. A alteração desses três parâmetros pelo US sugere que a entrega de DNA plasmideal deva ocorrer por endocitose. Por fim, utilizando DNA plasmideal fluorescente, mostramos que esta molécula entra na célula via endocitose mediada por clatrina.