Clonagem, expressão e purificação de proteínas do SARS-CoV-2

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Castro, Danielly Bittencourt [UNIFESP]
• Orientador(a): De Moraes, Jane Zveiter [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• dARK ID: ark:/48912/001300001vwns
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo
• Palavras-chave em Português: SARS-CoV-2; Proteína spike; Proteína nucleocapsídeo; Ômicron
• Palavras-chave em Inglês: Wuhan
• Link de acesso: https://hdl.handle.net/11600/73952

Introdução: A pandemia de COVID-19, causada pelo SARS-CoV-2, impactou significativamente a saúde global, mobilizando diversos grupos para o estudo da biologia do vírus, em busca de melhor entendimento e desenvolvimento de métodos diagnósticos, terapias e vacinas. As proteínas estruturais Nucleocapsídeo (N) e Spike (S) desempenharam papéis cruciais no desenvolvimento dessas ferramentas, devido à importância no ciclo viral, em que a N é envolvida no empacotamento do RNA do vírus, enquanto a S na internalização do SARS-CoV-2 na célula hospedeira. Objetivos: Clonar, expressar e purificar as proteínas N (Wuhan) e S (Ômicron) do vírus SARS-CoV-2 em sistema procarioto de expressão. Por fim, avaliar se as proteínas recombinantes obtidas seriam reconhecidas por soros hiperimunes. Métodos: O gene da proteína N foi clonado no vetor pET-26b(+) e o da proteína S, contendo as porções correspondentes às subunidades S1 e S2 sem a região transmembranar, denominada de S1-S2, no vetor pGEX-4T-2, ambos pelo método TEDA (do inglês, T5 exonuclease-dependent assembly). As cepas de E. coli das linhagens BL21 (DE3) e Rosetta (DE3) foram utilizadas para expressão das proteínas N e S1-S2, respectivamente. As proteínas foram extraídas através de lise ultrassônica, e para a purificação foram utilizados diferentes métodos de cromatografia. Para avaliar as proteínas obtidas realizaram-se ensaios imunoenzimáticos contra soros hiperimunes. Resultados: As construções plasmidiais obtidas no processo de clonagem tiveram sua integridade avaliada através de análise de restrição e por sequenciamento de Sanger. A proteína N pôde ser expressa de forma eficiente permanecendo na fração solúvel, e a presença da cauda His facilitou a purificação da proteína de interesse por IMAC (cromatografia de afinidade em metal imobilizado). No entanto, para a proteína recombinante S1-S2 enfrentamos maiores desafios para sua obtenção. Com a proteína permanecendo insolúvel na forma de corpos de inclusão, realizamos a solubilização em tampão com 8M de ureia, seguida das tentativas de renaturação, através de protocolos de renaturação rápida e lenta. Em ambos os processos de renaturação, não foi possível realizar a purificação utilizando a cromatografia de afinidade, provavelmente por não ter sido possível renaturar a GST apropriadamente, e a proteína obtida pelo processo de renaturação lenta foi reconhecida pelo soro hiperimune nos testes imunoenzimáticos. A partir destes resultados, conseguimos definir um protocolo que permitiu a purificação da proteína S1-S2 por cromatografia de exclusão de massas, seguida pelo processo de renaturação lenta. Ambas as proteínas foram reconhecidas por soros hiperimunes de indivíduo vacinado com CoronaVac e a proteína N também pelo soro de camundongos imunizados. Conclusões: As proteínas recombinantes N e S1-S2 foram expressas e purificadas com sucesso em sistema procarioto. A renaturação lenta da proteína recombinante S1-S2 foi mais eficiente que a renaturação rápida. Ambas as proteínas N e S1-S2 foram reconhecidas pelos anticorpos policlonais dos soros hiperimunes nos ensaios de ELISA. Neste trabalho, obtiveram-se as proteínas recombinantes N e S1-S2, que poderão ser utilizadas na seleção de anticorpos monoclonais, e nos estudos futuros do grupo, incluindo investigações sobre a interação entre idiotipo e anti-idiotipo dos anticorpos contra essas proteínas.