Identificação e análise de microRNAs possivelmente envolvidos na regulação da via de sinalização celular associada ao processo de angiogênese estimulado por bradicinina e mediada pelo VEGF, EGFR e pelo radical livre NO

• Ano de defesa: 2017
• Autor(a) principal: Albuquerque, Maria Theresa Oliveira de Medeiros [UNIFESP]
• Orientador(a): Monteiro, Hugo Pequeno [UNIFESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• dARK ID: ark:/48912/001300002n5vd
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: MicroRNAs; Óxido nítrico; Angiogênese; VEGF; EGFR; Neovascularização fisiológica; Receptores de fatores de crescimento do endotélio vascular; Genes erbB-1
• Palavras-chave em Inglês: MicroRNAs; Nitric oxide; Angiogenesis; VEGF; EGFR; Neovascularization, Physiologic; Receptors, vascular endothelial growth factor
• Link de acesso: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=4837432; https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50801

A angiogênese é um processo que consiste na formação de novos vasos a partir de vasos pré-existentes, e que resulta da ativação das vias de sinalização desencadeadas por VEGF, EGF e seus receptores, e associadas à produção de NO, que então as regula e modula. O objetivo deste trabalho foi identificar miRs possivelmente envolvidos nessas vias relacionadas à angiogênese, e cujo modelo in vitro envolve o estímulo de células endoteliais por BK. Para tanto, foram utilizadas as seguintes metodologias: perfil de expressão e/ou atividade de proteínas por Western blot, ciclo celular por citometria de fluxo, estimativas da concentração de NO por NO Analyzer, formação de capilares em Matrigel (angiogênese in vitro), e expressão de miRs por miRarray e qRT-PCR. Como resultado, o estímulo por BK desencadeou uma via de sinalização constituída pelo EGFR, VEGF, ERK1/2 MAPK e pela eNOS. Estimativas da concentração de NO revelaram uma elevação nos níveis de NO após estímulo com BK, e redução destes ao se adicionar inibidores das proteínas da via acima mencionada. Ao se avaliar os níveis de expressão (VEGF e EGFR) e de fosforilação (ERK1/2 MAPK e eNOS), observou-se que BK promoveu aumento na expressão e/ou atividade destas, enquanto que os inibidores promoveram diminuição nos níveis de expressão de VEGF e EGFR e de fosforilação das ERK1/2 MAPK e eNOS. Análise das fases do ciclo celular revelou que, em células tratadas por BK, o percentual de população na fase G2 era maior após 2h. Já a inibição da eNOS por L-NIO reduziu este percentual, sugerindo que a inibição da eNOS e consequentemente a redução nos níveis intracelulares de NO resultam em parada do ciclo. Ao se avaliar a formação dos capilares a partir de células endoteliais semeadas em Matrigel, verificou-se que a formação destes foi estimulada por BK e inibida quando as células eram pré-incubadas com os inibidores específicos da via. Ao se investigar a participação de miRs como possíveis reguladores do processo, foram identificados 9 miRs pró e 8 miRs anti-angiogênicos in silico. Ensaios de miRarrays demonstraram aumento da expressão de quase todos os miRs após estímulo por BK, enquanto que o uso de L-NIO ampliou os níveis dos anti-angiogênicos. Ainda, com base nos resultados obtidos foram seleciondos dois miRs: miR-21 (anti-angiogênico) e miR-126 (pró-angiogênico) para validação. MiR-126 foi estimulado em todos os períodos de estímulo com BK, enquanto que o emprego dos inibidores indicou, no geral, aumento nos níveis de expressão do miR-21 e manutenção dos níveis de expressão do miR-126 por até 2 horas. Concluiu-se que o NO é um mediador importante do processo angiogênico estimulado por BK e associado à via de sinalização constituída pelas proteínas EGFR, VEGF, ERK1/2 MAPK e eNOS. Mais ainda, esta mediação pode ser exercida através da modulação dos níveis de expressão de miRs pró e anti-angiogênicos.