Construção de uma biblioteca de inibidores de proteases em sistema phage display e seleção de inibidores específicos para proteases digestivas de larvas de Aedes aegypti

• Ano de defesa: 2017
• Autor(a) principal: Manzato, Veronica de Moraes [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• dARK ID: ark:/48912/001300002r78p
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: Aedes aegypti; Digestive enzymes; Phage display; Serinoprotease inhibitors; Larvas; Peptide library; Insect proteins; Insect vectors; Trypsin inhibitors; Enzimas digestivas; Inibidores de serinoproteases; Biblioteca de peptídeos; Proteínas de insetos; Insetos vetores; Dengue; Inibidores da tripsina
• Link de acesso: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5082781; http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50545

O mosquito Aedes aegypti é vetor de arboviroses como febre amarela, dengue, zika, chikungunya e está adaptado ao ambiente urbano. Considerado problema de saúde pública mundial, os surtos de dengue costumam ter ciclos a cada 3-5 anos, com aumento de virulência e expansão a cada ciclo. Como não há tratamento, a profilaxia inclui vacinação, porém, a vacina contra a dengue apresenta baixa eficácia, portanto o controle da doença é feito principalmente pelo controle do vetor, o mosquito Ae. aegypti. Até o momento não existe um método eficiente de controle do mosquito, o que se agrava com a presença de linhagens resistentes aos inseticidas e larvicidas. Sabendo que a larva se alimenta constantemente, pretendemos interferir no desenvolvimento da larva por meio da inibição da digestão de proteínas. Neste trabalho, utilizamos a técnica de phage display e um inibidor de elastase de neutófilos e quimotripsina presente em ovos de Triatoma infestans denominado TiPI (Triatoma infestans Pacifastin Inhibitor) mutados na região do sítio reativo (P2-P2’) randomicamente. As proteínas mutadas expostas em sua conformação ativa na superfície do fago foram selecionadas em extrato de intestino de larva 4° instar de Ae. aegypti. A análise das sequências de DNA dos clones selecionados evidenciou um grupo de 11% de clones possíveis inibidores de tripsina com Arg ou Lys em P1, 18,5% de clones possíveis inibidores de elastase com Ala, Leu ou Val em P1 e curiosamente, o maior grupo representado por 47%, de clones com Gln em P1 e 88,8% com Gln em qualquer posição da região mutada. Dez clones foram selecionados para a produção de fagos de fusão, sendo 4 possíveis inibidores de tripsina, clone 73 (QRLQ), clone 154 (LKQL), clone 161 (KRKQ) e clone 189 (QRHL), 2 clones inibidores de quimotripsina, clone 29 (ALAR) e clone 143 (LLQC) e os 4 clones mais frequentes, clone 4 (SQWH), clone 5 (QSAM), clone 16 6 (HQSL) e clone 22 (AQVF) os quais foram avaliados sobre proteínas do extrato de intestino de larva de Ae. aegypti e enzimas comerciais pelo método de ressonância plasmônica de superfície. Devido aos dados inconclusivos, os mesmos foram expressos em sistema de levedura Pichia pastoris. O sobrenadante de cultura de levedura contendo as proteínas recombinantes foram avaliados quanto à sua atividade inibitória. Dentre os inibidores de tripsina, o clone 73.21 apresentou a melhor atividade inibitória para tripsina, enquanto o clone 29.14 se destacou na inibição para elastase de neutrófilos. Os clones 4.27, 5.26 e 6.27 apresentaram atividade inibitória para subtilisina A. Os resultados obtidos neste trabalho confirmam que a biblioteca de mutantes em fagos filamentosos e a seleção para enzimas digestivas de larvas de Ae. aegypti permitiram a obtenção de inibidores para estas enzimas. Estes dados iniciais são promissores e a melhor caracterização dessas moléculas é essencial para que sejam utilizadas no desenvolvimento de inibidores sintéticos e específicos com ação larvicida, para o controle do vetor.