Caracterização molecular e bioquímica de variantes de Oxa-50 em isolados de Pseudomonas aeruginosa

• Ano de defesa: 2017
• Autor(a) principal: Oliveira, Ana Paula Streling de [UNIFESP]
• Orientador(a): Gales, Ana Cristina [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• dARK ID: ark:/48912/001300001jfg3
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: Oxacilinases; Bacilo gram-negativo não-fermentador; β-lactâmico; Cinética enzimática; Pseudomonas aeruginosa
• Palavras-chave em Inglês: Pseudomonas aeruginosa
• Link de acesso: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50683; https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5006569

RESUMO As enzimas do tipo OXA-50 representam um grupo de oxacilinases cromossômicas intrínsecas de Pseudomonas aeruginosa. No presente estudo, caracterizamos as propriedades bioquímicas e moleculares de três variantes de OXA-50 isoladas de P. aeruginosa. Foram selecionadas três cepas, sendo estas: Pb9 (blaOXA-488) - cepa clínica apresentando um fenótipo raro e emergente de resistência aos carbapenens e sensibilidade às cefalosporinas de amplo espectro (ESCph); P-1088 (blaOXA-494) - primeiro isolado produtor de SPM-1; e PA01 cepa carreadora do gene blaOXA-50 original utilizada também como controle nos ensaios de qRT-PCR. O contexto genético do blaOXA-50-like da Pb9 e P-1088 foram sequenciados e comparados com a PA01. Os fragmentos gerados pela reação de PCR do gene blaOXA-50-like foram clonados no vetor pET-26b+ e os plasmídeos recombinantes foram expressos em cepas de Escherichia coli BL21 (placas de LB ágar + 50 μg/mL de canamicina). As CIMs para os clones transformantes foram determinados por Etest®. A produção da OXA-50 e de suas variantes foram induzidas em 1 L de caldo LB suplementado com 0.25 mM de IPTG e incubados durante a noite à 20°C. As β- lactamases foram liberadas do espaço periplasmático por choque osmótico e purificadas por cromatografia de exclusão molecular e troca iônica. Para a triagem inicial da hidrólise das enzimas frente aos β-lactâmicos foi realizada a cromatografia de alta eficiência (HPLC) para 10 diferentes antimicrobianos usando uma coluna C18 de 1 mL através de um gradiente linear de acetonitrila. Os ensaios cinéticos foram realizados apenas para os antimicrobianos que apresentaram hidrólise positiva no HPLC. Os níveis transcricionais dos genes mexB, mexD, mexF and mexY, ampC, poxA, poxB e oprD foram avaliados pela técnica de qRT-PCR. A OXA-488 e a OXA-494 diferem da OXA-50 em três (Gly14Ala, Thr16Ala, Arg49Leu) e dois aminoácidos (Asp109Glu and Arg167His), respectivamente. Todos os genes blaOXA-50-like avaliados eram flanqueados a montante pelo gene poxA e a jusante por uma ORF que codifica uma proteína hipotética de 407 bp. A falta de uma região promotora na região intergênica, e a presença de uma região ρ-terminadora a montante do gene blaOXA-50-like, indicam que estes genes formam um operon (poxAB). Mutações no gene poxA foram encontrados nas cepas P1088 (Phe7Ser, Ala50Thr and Thr232IIe) e Pb9 (Phe7Ser and Asp279Ala). A análise realizada por HPLC demonstrou que todas as variantes de OXA-50 foram capazes de hidrolisar benzilpenicilina, ampicilina, oxacilina, ticarcilina e imipenem. No entanto, as CIMs para benzilpenicilina e carbapenêmicos não demonstraram diferenças quando comparadas à cepa selvagem BL21 para os clones transformantes. Em concordância com os dados do HPLC, os ensaios cinéticos demonstraram boa eficiência catalítica das enzimas testadas frente à benzilpenicilina e à oxacilina. Entretanto, todas as variantes de OXA-50 avaliadas não hidrolisam ticarcilina eficientemente. Entre as variantes avaliadas, a OXA-488 demonstrou melhor atividade catalítica frente ao imipenem. Os sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexXY-OprM estavam hiperexpressos nas cepas Pb9 (3,06 vezes) e P1088 (16,48 vezes), respetivamente. Embora aexpressão dos genes blaOXA-488 e blaOXA-494 estivesse aumentado de ~4x e ~3x em relação ao gene blaOXA-50, seus respectivos genes poxA tiveram a expressão aumentada em apenas 1,18 e 1,13 vezes. Nossos resultados demostraram que a OXA-50 e suas variantes podem hidrolisar imipenem, mas não meropenem, ticarcilina e ESCph. Além disso, as baixas CIMs para os carbapenêmicos verificadas entre os clones transformantes podem ser devido ao hospedeiro utilizado no ensaio de transformação.