Identificação de proteínas imunoreativas de Staphylococcus aureus isolado de mastite bovina

• Ano de defesa: 2010
• Autor(a) principal: Fabres, Mary Hellen Araújo
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal; Mestrado em Bioquímica Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: Proteínas imunoreativas; Staphylococcus aureus; Mastite bovina; Immunoreactive proteins; Bovine mastitis; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2462

A mastite estafilocócica é uma infecção comum que pode evoluir para a forma crônica. O diagnóstico precoce é de grande importância devido ao elevado custo da mastite, além dos riscos para a saúde humana. Essa pesquisa visou à identificação de proteínas imunogênicas para fins de diagnóstico da mastite causada por Staphylococcus aureus. Dentro deste propósito foi utilizada a técnica de Western blotting para seleção de imunógenos específicos expressos durante a infecção. Para isso foram preparados extratos protéicos de Staph. aureus ATCC 33591, Staph. aureus 3993, 4124 e 4163, além de outros patógenos relacionados à mastite como Staph. epidermidis, Staph. intermedius, Staph. chromogenes, Staph. hyicus coagulase positivo e Strep. agalactiae. As proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE 14% e eletrotransferidas para membrana de nitrocelulose. A imunodetecção foi realizada com antisoro produzido a partir de extrato de proteínas totais preparadas de culturas na fase estacionária (FE) ou logarítmica (FL). Na imunodetecção das proteínas secretadas e das proteínas de parede celular com extrato obtido na FE foram observadas duas e cinco bandas específicas, respectivamente, que foram excisadas do gel e submetidas à digestão tríptica para o sequenciamento por espectrometria de massa. Outra estratégia para seleção de proteínas imunogênicas foi a construção uma biblioteca genômica de Staph. aureus em vetor pUC18 usando fragmentos de DNA entre 0,5 e 8 kb. Para o screening da biblioteca, foi utilizado antisoro produzido a partir de extrato de proteínas totais do patógeno. Essa metodologia possibilitou a identificação de 74 clones positivos, entre os quais 20 foram selecionados para sequenciamento. As sequências de nucleotídeos foram alinhadas com o genoma de Staph. aureus RF122 de origem bovina, possibilitando a identificação de 18 diferentes loci que incluem proteínas relacionadas ao metabolismo, adesão, parede celular, toxinas, proteínas regulatórias, adesinas, proteínas de parede celular e proteínas hipotéticas. A proteína de ligação ao fibrinogênio (Efb) codificada pelo gene fib mostrou-se específica de Staph. aureus sendo, dessa forma, candidata promissora para o desenvolvimento de sorodiagnóstico para a mastite estafilocócica. As proteínas identificadas neste trabalho serão expressas e novamente ensaiadas por métodos imunológicos.