In vitro neoformation of organs in Bixa orellana L.: morphoanatomy, cloning and characterization of pluripotency-associated putative transcription factors

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Correia, Ludmila Nayara de Freitas
• Orientador(a): Otoni, Wagner Campos
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: eng
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa
• Área do conhecimento CNPq: Fisiologia Vegetal
• Link de acesso: https://locus.ufv.br//handle/123456789/27698

A pluripotencialidade é uma característica das células vegetais que permite uma única célula originar a maioria dos tecidos que irão compor o corpo da planta. A organogênese é uma via de regeneração que se baseia nesses princípios para induzir a neoformação de órgãos. Os hormônios de crescimento vegetais associados aos eventos moleculares são essenciais para o sucesso dessa via morfogênica. Diante disto, os objetivos desse trabalho foram: avaliar a responsividade morfogênica in vitro de diferentes explantes de Bixa orellana submetidos a condições de indução organogênica; caracterizar as mudanças citológicas que ocorrem durante a formação de brotos e raízes, acompanhar a mobilização de reservas; e isolar e caracterizar genes expressos durante os eventos organogênicos. Para avaliar a formação de brotos hipocótilos, hipocótilos feridos, hipocótilos enraizados inoculados com a polaridade invertida, e folhas pecioladas foram inoculados em meio JADS suplementado com vitaminas B5, sacarose (3% w/v), mio-inositol (0,01% w/v), ágar (0,6% w/v) e 4,56 μM de zeatina, 2,07 ou 4,14 μM de meta-topolina. Amostras com 0, 3, 6, 9, 18, 21, 24, e 30 dias foram coletadas para microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, e testes histoquímicos todas seguindo protocolos específicos. Para avaliar a formação de raízes, plântulas foram inoculadas em meio JADS em condições similares citadas acima, mas contendo 0 ou 2,46 μM de ácido indolilbutríco (AIB). Após 0, 2, 4, 6, 8, 10, 18, e 20 amostras foram coletadas e procedimento citados acima foram seguidos. A partir de material organogênico extraiu-se o RNA total e obteve-se o cDNA, o qual serviu como molde para amplificação das sequências codantes utilizando-se primers degenerados para os genes BABY BOOM (BBM) e SHOOT MERISTEMLESS (STM). Observou-se que em B. orellana tanto a zeatina quanto a meta topolina induziram a formação de brotos, porém o ferimento do hipocótilo, bem como a inversão da polaridade em hipocótilos enraizados otimizaram o processo, quando comparados aos hipocótilos e folhas pecioladas. As primeiras divisões celulares foram observadas nas primeiras semanas de cultivo em meio de indução, principalmente em explantes cultivados em 7meio acrescido de zeatina. Após 30 dias de cultivo, zeatina e meta topolina induziram a formação de estruturas caulinares e diferenciação de primórdios foliares nos explantes avaliados. Na histoquímica, reservas proteicas foram evidenciadas principalmente em hipocótilos enraizados e folhas pecioladas. Grãos de amido foram evidenciados em todos tipos de explante avaliados, e um aumento gradual na concentração desse composto de reserva foi observado ao longo do período de indução. O teste de vermelho neutro não indicou a presença de lipídios durante o processo organogênico. Explantes caulinares cultivados em meio JADS com AIB apresentaram divisões celulares após quatro dias de cultivo, que deram origem a primórdios de raízes laterias. A manutenção em meio de indução, suplementado com AIB, por 20 dias levou a formação de raízes laterais. Neste mesmo período primórdios de raízes laterais foram notados no controle. Os testes histoquímicos evidenciaram a presença de proteínas, que foram consumidas ao longo do evento organogênico, além de grãos de amido e lipídios presentes em todos os tempos avaliados. Sequências consenso obtidas a partir de primers dos degenerados de BBM e STM foram clonadas e sequenciadas. As sequências consenso obtidas foram comparadas em bancos de proteínas não redundantes do NCBI, Phytozome e TAIR, usando o algoritmo BLAST. A análise e o alinhamento das sequências geraram três contigs semelhantes a membros da família APETALA2-like, especialmente BBM, WRINKLED (WRI) e AINTEGUMENTA (ANT), e três contigs com alta similaridade aos fatores de transcrição da Class I KNOX, especialmente STM. Estes resultados demonstram as respostas morfogênicas de diferentes tipos de explantes submetidos aos meios de indução, e os possíveis membros das famílias AP2-like e Class I KNOX clonados a partir das sequênicas analisadas, e que estão associadas com a aquisição de competências para formação de órgãos in vitro em Bixa orellana.