Uso de sondas fluorescentes para avaliação seminal de ejaculado de gato do mato pequeno (Leopardus tigrinus) e ensaio de ligação à membrana perivitelina de ovo de galinha (Gallus gallus) como ferramenta de predição de fertilidade espermática

• Ano de defesa: 2012
• Autor(a) principal: Garay, Rafael de Morais
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Biotecnologia, diagnóstico e controle de doenças; Epidemiologia e controle de qualidade de prod. de; Mestrado em Medicina Veterinária; UFV
• Palavras-chave em Português: Sondas fluorescentes; Membrana perivitelínica; Felinos; Fluorescent probes; Perivitelline layer; Cats; CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA::REPRODUCAO ANIMAL
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/5101

Diversas populações de carnívoros silvestres encontram-se ameaçados de extinção, principalmente devido à descaracterização de habitats e a baixa variabilidade genética de populações geograficamente isoladas. Estratégias de conservação ex situ, dentre as quais se encontram a reprodução assistida e criopreservação de gametas visam auxiliar a manutenção de populações viáveis. O processo de criopreservação de gametas masculinos, porém, gera danos às células, os quais devem ser mensurados a fim de se avaliar metodologias e técnicas de manipulação e consequentemente aumentar a viabilidade de reprodução de espécies ameaçadas mantidas em cativeiro, a partir da utilização de reprodução assistida. O estudo teve por objetivo avaliar de forma qualitativa o ejaculado a fresco e descongelado de gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus) utilizando-se a combinação de sondas fluorescentes e testes de ligação de espermatozoides a ovócitos heterólogos de gatas domésticas e à membrana perivitelina do ovo de galinha. Foi utilizado um gato-do-mato-pequeno, que foi anestesiado por meio de protocolo anestésico de cloridrato de quetamina (10 mg/kg) e cloridrato de xilazina (1,2 mg/kg). O sêmen foi coletado pelo uso de eletroejaculação e foi avaliado quanto aos aspectos físicos (cor, aspecto e volume) e também foram realizados os testes de rotina a seguir: motilidade espermática, vigor espermático, concentração de espermatozoides no ejaculado, morfologia e teste hiposmótico. Posteriormente o sêmen foi criopreservado em palhetas francesas na concentração de 20 x 106 espermatozoides móveis/mL, em meio à base de TRIS citrato, 20% de gema de ovo e concentração final de 6% de glicerol e 0,5% de Equex. Para a avaliação da integridade das membranas plasmática e acrossomal foi usada a combinação de três sondas fluorescentes, iodeto de propídio (IP), Hoescht 33342 (H342) e a aglutinina Pisium sativum conjugada com isoticionato de fluoresceína (FITC-PSA). Para os testes de ligação de espermatozoides à zona pelúcida de ovócito de gata doméstica e à membrana perivitelina de ovos de galinha, o sêmen foi coincubado na concentração de 0,5 x 106 espermatozoides móveis/mL, em meio de manutenção TCM 199 modificado e mantido em estufa a 38ºC com pressão atmosférica de 5% de CO2 durante uma hora. Os ejaculados obtidos apresentaram valores médios satisfatórios para vigor e motilidade (4,33% e 80,0%, respectivamente), porém, diminuíram no sêmen descongelado (p<0,05). O ejaculado a fresco apresentou-se com valores de patologias espermáticas abaixo do observado em outros estudos com sêmen a fresco de gato-do-mato (19%), no sêmen descongelado houve aumento de espermatozoides defeituosos (p<0,05), devido exclusivamente ao aumento nos defeitos maiores. O percentual de células reativas ao teste hiposmótico foi menor (p<0,05) no sêmen descongelado em relação ao sêmen a fresco (13,0% e 71,66%, respectivamente). A associação das sondas IP, H342 e FITC-PSA mostrou-se eficaz para a distinção de diferentes subpopulações de espermatozoides em um mesmo ejaculado, porém houve dificuldade em se identificar a coloração pelo FITC-PSA em associação com o H342. Houve redução (p<0,05) da população com membrana plasmática e acrossomal íntegras no sêmen descongelado em relação ao sêmen a fresco e aumento na população com membrana plasmática lesionada e acrossomal íntegra, que foi inversamente proporcional à motilidade entre estes dois tratamentos. Em relação aos testes de ligação de espermatozoides a ovócitos heterólogos e a membranas perivitelina, tanto o sêmen a fresco quanto o descongelado de gato-do-mato-pequeno apresentaram adesão aos substratos testados e ocorreu redução (p<0,05) na quantidade de espermatozoides aderidos nos ovócitos e nas membranas no sêmen descongelado. As metodologias de avaliação qualitativa de associação de sondas fluorescentes e testes de ligação de espermatozoides a ovócitos e membrana perivitelina de ovo de galinha se mostraram úteis na avaliação de sêmen a fresco e descongelado de gato-do-mato-pequeno.