Clonagem e caracterização de análogos de genes de resistência e desenvolvimento de um marcador SCAR Iigado ao gene Ppr1 em Eucalyptus grandis

• Ano de defesa: 2001
• Autor(a) principal: Laia, Marcelo Luiz de
• Orientador(a): Alfenas, Acelino Couto
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa
• Área do conhecimento CNPq: Ciências Agrárias
• Link de acesso: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/10102

A maioria dos genes de resistência (genes R) cIonados codifica proteínas que tém dominios conservados. Estas proteinas sao classificadas em classes ou subclasses de acordo com a presenca ou ausência desses domínios. Domínios do tipo LRR (Leucine rich repeat) e NBS (Nucleotide binding site) são os mais freqüentes em produtos dos genes R de mono e dicotiledôneas. A presença desses domínios conservados permite o uso da técnica de PCR com vistas ao isolamento e a clonagem de sequências análogas a genes de resistência (RGA - ReS/Stance Gene Ana/og), mediante o uso de oligonucleotídeos degenerados específicos para regiões conservadas. Associado a mapeamento genético, essa abordagem pode facilitar a clonagem e caracterização de novos genes R. Visando a clonagem e caracterização do gene Ppr1, que confere resistência a ferrugem em E. grandis, procurou-se neste trabalho identificar RGA’s que cossegregassem com este gene. Seqüências análogas a genes R foram amplificadas a partir do DNA isolado de uma matriz de E. grandis resistente a ferrugem, com o uso de oligonucleotídeos degenerados que aneIam a seqüências que codificam domínios conservados de proteínas de resistência. Os fragmentos amplificados (~6OO pb) foram clonados no vetor pGEMT-Easy, transformados em E. coli e seqüênciados. Utilizando-se como critérios o tamanho, o rendimento e a qualidade do DNA, 13 clones, dentre noventa obtidos, foram selecionados (ML 5, ML 21, ML 23, ML 25, ML 27, ML 28, ML 29, ML 31, ML 32, ML 33, ML 34, ML 35 e ML 38) para seqüenciamento. Os clones foram comparados entre si e com outros genes de resistência já caracterizados, com base nas suas seqüências de aminoácidos deduzidas. A análise com o algoritmo Blastx revelou que os clones ML27 e ML34 são similares ao gene N de Nicotiana glutinose e RPSS de Arabidopis thaliana, respectivamente. Além disso, o clone ML27 também foi similar a um homólogo do gene N presente em Pinus radiata. Os clones ML28, ML21, ML23, ML29 e ML38 não mostraram similaridade significativa com seqüências depositadas em bancos de dados e o clone ML05 possui NBS similar a de um provável transportador ABC de arabidopsis. Embora estes clones tenham revelado vários locos RFLP polimórficos entre progenitores da população estudada, nenhum desses polimorfismos cossegregou com o gene Ppr1. Uma segunda fase do trabalho consistiu no desenvolvimento de marcadores SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) a partir do marcador RAPD AT9917. Para tal, o DNA da matriz G21 (E. grandis) foi amplificado com o oIigonucIeotídeo AT9 e o fragmento de 917pb foi purificado do gel, cIonado em vetor apropriado e multiplicado em E. coli DH5α. A partir da seqüência de nucleotídeos deste fragmento, desenharam-se quatro oligonucIeotídeos no sentido direto e três no sentido reverso. Os oligonucleotídeos foram combinados entre si a fim de identificar um par que gerasse polimorfismo entre o genótipo resistente (G21) e o genótipo suscetível (G38). Não foi possível obter polimorfismo a partir da amplificação, mas após clivagem do produto da PCR com a enzima de restrição Cfo I, obteve-se uma banda de aproximadamente 800 pb que cossegregou com o fenótipo de resistência. Todavia, esta banda não cossegregou com o fenótipo de resistência em outras famílias oriundas do mesmo genitor G21.