Caracterização bioquímica e análise estrutural in silico de Thimet Oligopeptidase de Trypanosoma cruzi

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2022
Autor(a) principal: Cardoso, Isabela da Cunha Costa
Orientador(a): Bastos, Izabela Marques Dourado
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Link de acesso: http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/45846
Resumo: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2022.
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spelling Cardoso, Isabela da Cunha CostaBastos, Izabela Marques Dourado2023-04-28T21:49:17Z2023-04-28T21:49:17Z2023-04-282022-10-21CARDOSO, Isabela da Cunha Costa. Caracterização bioquímica e análise estrutural in silico de Thimet Oligopeptidase de Trypanosoma cruzi. 2021. 88 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular) — Universidade de Brasília, Brasília, 2021.http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/45846Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2022.A Doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, que é transmitido principalmente através da picada do inseto barbeiro e da ingestão de alimentos contaminados, atingindo de 6 a 7 milhões de pessoas no mundo. A doença é caracterizada por causar sintomas agudos leves, mas em cerca de 30% dos casos evolui para a fase crônica com acometimento de órgãos como o coração e o intestino. Até o momento, não existe vacina e o tratamento baseia-se em dois medicamentos de pouca eficácia sobretudo na fase crônica da doença. O desenvolvimento de alternativas quimioterápicas menos tóxicas requer a busca por moléculas-alvo vitais para o protozoário que possam ser inibidas de maneira específica, como as enzimas. A thimet oligopeptidase (TOP) é uma metaloprotease dependente de zinco pertencente à família M3 que tem como principal substrato a bradicinina, peptídeo vasoativo que aumenta a permeabilidade vascular. Em humanos, a TOP é uma das principais processadoras intracelulares de oligopeptídeos, atuando na seleção de antígenos apresentados pelo MHC-I em casos de infecção viral e câncer, por exemplo. Devido à escassez de informações acerca da TOP em protozoários, pouco ou quase nada se sabe sobre o papel da TOP de T. cruzi (TOPTc). Diversos estudos apontam a sua presença em secretomas ou na superfície do parasito em diferentes fases do seu ciclo de vida, indicando uma possível e provável interação direta com a célula hospedeira. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi expressar a TOPTc recombinante em E. coli, realizar sua caracterização bioquímica e elaborar uma análise estrutural por meio de modelagem molecular. Dentre os principais resultados, foi observado que a enzima foi ativa sobre o substrato Mca-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Lys(Dnp) com Km de 24,89 µM em 50 mM de tampão fosfato pH 7.0 como tampão ótimo de atividade. A atividade da TOPTc é dependente de zinco, apresenta termofilicidade e sua inibição não é afetada por EDTA, porém é inibida por Cpp-Ala-Ala-Phe-pAb com IC50 de 54,29 nM. Dentre os modelos 3D gerados, o obtido pelo Alphafold apresentou melhores parâmetros tais quais menor MolProbity score e maior Ramachandran Favored score. Por fim, anticorpos específicos produzidos contra a enzima, mostraram uma marcação próxima a bolsa flagelar do parasito, local de intensa troca de moléculas com o meio extracelular. Esse trabalho representa o primeiro estudo de TOP de protozoários, com a caracterização de parâmetros bioquímicos, de localização e de estrutura, que contribuirá especialmente para a busca de inibidores capazes de romper o ciclo de vida do parasito, visando um futuro tratamento para a doença de Chagas.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).Chagas disease is a neglected disease caused by the protozoan Trypanosma cruzi, that is mainly transmitted by the insect vector commonly known as kissing bug, affecting over 6 million people worldwide. The symptoms are generally mild and acute, but approximately 30% of the cases evolve to the chronic phase where organs such as the heart and intestine are compromised. To this moment, there is no effective vaccine and the treatment is based on two drugs of small efficacy that are not capable of treating the chronic phase of the disease. The development of less toxic chemotherapeutic alternatives requires the search for target molecules that are vital for the protozoan and can be inhibited in a specific manner, such as enzymes. Thimet oligopeptidase (TOP) is a zinc-dependent metallopeptidase belonging to the M3 family that cleaves bradykinin, a vasoactive peptide that increases vascular permeability. In humans, TOP is one of the main intracellular oligopeptides processor, selecting antigens presented by the MHC-I in cases of viral infections and cancer. Due to scarce information on TOP in protozoans, little is known about the role of TOP in T. cruzi (TOPTc). However, TOPTc has been identified in the secretome and in the surface of the parasite in different phases of its life cycle, indicating a possible interaction with the host cell. In this context, the objective of this work was to express recombinant TOPTc in E. coli, perform its biochemical characterization and elaborate a structural analysis through molecular modelling, providing, thus, relevant information for the study of this enzyme, such as optimal pH, temperature and buffer, optimal concentration of ions, inhibitory effect and kinetic aspects of the enzyme. Among the main results, we observed that the enzyme is active towards the substrate Mca-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Lys(Dnp), with Km of 24,89 µM in 50mM phosphate buffer pH 7.0. TOPTc activity is dependent on zinc and the enzyme is thermophilic. Inhibition is not affected by EDTA, but the enzyme is inhibited by Cpp-Ala-Ala-PhepAb, with an IC50 of 54,29nM. The 3D model generated by AlphFold showed the best parameters such as smaller MolProbity score and larger Ramachandran Favored score. Finally, anti-TOPTc specific antibodies colocalized in the flagellar pocket, where molecules are released to the extracellular milieu. This work represents the first study of TOP in protozoans and presents new observations related to this class of enzymes that will contribute to the development of new inhibitors molecules capable of disrupting the parasite life cycle and aid in the search for a treatment for Chagas’disease.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Programa de Pós-Graduação em Biologia MolecularporA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessCaracterização bioquímica e análise estrutural in silico de Thimet Oligopeptidase de Trypanosoma cruziinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisChagas, Doença deMetaloproteaseCaracterização bioquímicaTrypanosoma cruzireponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBORIGINAL2022_IsabeladaCunhaCostaCardoso.pdf2022_IsabeladaCunhaCostaCardoso.pdfapplication/pdf2439810http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/45846/1/2022_IsabeladaCunhaCostaCardoso.pdf1f9243965905af7a473f0a3535e780ffMD51open accessLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain676http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/45846/2/license.txt59c0495af143a2dbef8cb1eca992b8cfMD52open access10482/458462024-03-07 00:32:22.631open accessoai:repositorio2.unb.br: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Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestopendoar:2024-03-07T03:32:22Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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