Caracterização funcional e estrutural de uma fosfolipase tipo A2 isolada da secreção cutânea do anuro Pithecopus azureus (Phyllomedusa azurea)

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2016
Autor(a) principal: Pinheiro, Andréia Camargo
Orientador(a): Pires Júnior, Osmindo Rodrigues
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Link de acesso: https://repositorio.unb.br/handle/10482/36159
Resumo: Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016.
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spelling Pinheiro, Andréia CamargoNoronha, ElianePires Júnior, Osmindo Rodrigues2020-01-17T18:58:25Z2020-01-17T18:58:25Z2020-01-172016-12-07PINHEIRO, Andréia Camargo. Caracterização funcional e estrutural de uma fosfolipase tipo A2 isolada da secreção cutânea do anuro Pithecopus azureus (Phyllomedusa azurea). 2016. xiv, 59 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal)—Universidade de Brasília, Brasília, 2016.https://repositorio.unb.br/handle/10482/36159Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016.A secreção cutânea de anfíbios é extremamente rica em moléculas bioativas, as quais protegem o animal desde diversos microrganismos à predadores. Em se tratando de riqueza, a família Phyllomedusa ganhou grande destaque, pois o tecido cutâneo das espécies que o compõem apresentaram grande diversidade de biomoléculas. Além dos peptídeos, uma enorme gama de substâncias químicas também são encontradas na secreção cutânea de anfíbios, tais como aminas, terpenos, esteroides, alcaloides e enzimas. Recentemente PLA2s estão sendo descritas em secreções de anfíbios, embora quase não haja sequência primária de aminoácidos destes animais publicada. As fosfolipases são enzimas esterolíticas as quais hidrolisam glicerofosfolipídeos, sendo as do tipo A2 (PLA2s) comumente presentes em peçonhas de serpentes. Estas enzimas regulam uma variedade de funções fisiológicas e fisiopatológicas e, quando alteradas no organismo, contribuem para diversas doenças humanas, sendo, portanto, alvos terapêuticos para a prevenção e tratamento de doenças. Assim, o objetivo desse estudo foi a caracterização funcional e estrutural de uma fosfolipase do tipo A2 presente na secreção cutânea do anfíbio brasileiro Pithecopus azureus. A secreção cutânea foi obtida por eletroestimulação, liofilizada e fracionada por meio de cromatografia líquida (RP-HPLC) obtendo-se aproximadamente 45 frações, as quais foram submetidas a um ensaio prévio de atividade enzimática para identificação da fração de interesse. A fração de interesse teve a massa de seus compostos analisados em MALDI-TOF/TOF. Purificada, a fosfolipase foi submetida ao ensaio de caracterização enzimática. A caracterização química parcial da fosfolipase foi obtida por espectrometria de massas, incluindo análises em MALDI TOF/TOF e LC MS/MS e pelo sequenciamento de novo obtido pelo PEAKS 7. Assim, a massa molecular média da enzima (de 15383 Da) foi obtida, bem como o sequenciamento de novo, com possíveis glicosilações. Análises da estrutura secundária e da estabilidade térmica foram feitas por dicroísmo circular, resultando em maior percentual em α-Hélice seguida de folha-β. A caracterização enzimática com determinação de Km e Vmax foi realizada, sendo comparada com outras fosfolipases que utilizaram o mesmo substrato. Por fim, para avaliar atividade biológica, a fosfolipase foi testada contra bactérias Gram-positivas e Gam-negativas, apresentando atividade. As análises estatísticas dos dados foram feitas por ANOVA.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).The skin secretions of amphibians are extremely rich in bioactive molecules, which protect the animal from different organisms and predators. When it comes to wealth, family Phyllomedusa has received a great attention because the skin tissue of the species that compose it showed great diversity of biomolecules. In addition of peptides, a wide range of chemicals are also found in skin secretion of amphibians, such as amines, terpenes, steroids, alkaloids and enzymes. Recently PLA2 are described in amphibians secretions, although there is almost no primary amino acid sequence published for these animals. Phospholipases are enzymes which hydrolyze estereolytic the glycerophospholipids, being the type A2 (PLA2) commonly present in venoms of snakes. These enzymes regulate a variety of physiological and pathophysiological functions whereby, when altered in the organism, contributes to many human diseases and being therefore therapeutic targets for the prevention and treatment of diseases. The objective of this study was the functional and structural characterization of a phospholipase A2 present in the skin secretion of the Brazilian frog Pithecopus azureus. The skin secretion was obtained by electrical stimulation, freeze-dried and fractionated by liquid chromatography (RP-HPLC) generating about 45 fractions which were previously submitted to enzymatic activity assay for identification of interest fraction. This mass was analyzed for MALDI-TOF/TOF. Purified, the phospholipase was submitted to enzymatic characterization test. The partial chemical characterization of phospholipase was obtained by mass spectrometry, including MALDI-TOF/TOF and LC-MS/MS analyzes. De novo sequencing was obtained with bioinformatics software PEAKS 7. Thus, the average molecular weight enzyme (from 15383 Da) was gotten, with possible glicosilation. Analysis of the secondary structure and thermal stability were made by circular dichroism, revealing a higher percentage of α-helices followed by β-leaves. The enzymatic characterization with Km e Vmax determination was made and compared to others phospholipases that used the same substrate. Lastly, the phospholipase had activity against Gram-positive and Gram-negative bacterial. All statistical analyzes of the data were made by ANOVA.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Programa de Pós-Graduação em Biologia AnimalA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessCaracterização funcional e estrutural de uma fosfolipase tipo A2 isolada da secreção cutânea do anuro Pithecopus azureus (Phyllomedusa azurea)info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisAnfíbioSecreção cutâneaAnfíbio - venenoFosfolipase A2Pithecopus azureusporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain671http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/36159/2/license.txtbacfee268cc5d4f6aaa2e6e0066d38f5MD52open accessORIGINAL2016_AndréiaCamargoPinheiro.pdf2016_AndréiaCamargoPinheiro.pdfapplication/pdf1452358http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/36159/1/2016_Andr%c3%a9iaCamargoPinheiro.pdf226f18cda262d5b15319ba7d78115070MD51open access10482/361592024-01-31 14:12:20.101open accessoai:repositorio2.unb.br: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Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestopendoar:2024-01-31T17:12:20Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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