Análise da infecção criptocócica latente e da reativação de células dormentes de cryptococcus neoformans associada ao metabolismo celular de macrófagos

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2023
Autor(a) principal: Marina, Clara Luna Freitas
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Cryptococcus neoformans
Dormência
Metabolismo
Macrófagos
Link de acesso: http://repositorio.unb.br/handle/10482/46747
Resumo: Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2023.
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Nesse trabalho analisamos os mecanismos envolvidos na reativação de C. neoformans durante infecção in vitro e in vivo e as alterações metabólicas induzidas por esse fungo nos macrófagos infectados. Para isso, infectamos macrófagos derivados de medula óssea (BMDM), pré-tratados ou não com LPS e IFN-γ com o nosso modelo de C. neoformans dormente (DCn), C. neoformans em crescimento estacionário (Stat) e mortos por calor (HK) + 1% Stat e analisamos a capacidade do DCn de reativar nessas condições e também a influência de vesículas extracelulares (EV) produzidas pelos BMDM. Para análise do metabolismo celular, analisamos a massa mitocondrial, despolarização da membrana mitocondrial, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), captura de glicose e ácidos graxos por citometria de fluxo. Além disso, analisamos o perfil respiratório das células infectadas por oximetria e empregamos RT-qPCR para quantificação da expressão de genes importantes no metabolismo celular. Para análise da reativação em um contexto in vivo, infectamos camundongos com fenótipo selvagem (WT) ou “Knockout” (KO) para expressão de IFN- γ ou óxido nítrico (NO), com DCn e seus respectivos controles. Observamos então, que a fagocitose é importante para estimular a reativação de DCn, apesar de não ser necessária, já que o contato com compostos extracelulares liberados pelos macrófagos é suficiente para induzir tal reativação e que esse processo é inibido na presença de LPS e IFN-γ. Observamos também que o DCn só reativou em camundongos imunossuprimidos com dexametasona (C57BL/6) deficientes na produção de IFN- γ ou em camundongos imunodeficientes na produção de linfócitos T (Balb/c nude), em que o fungo manteve sua virulência e migrou para o Sistema Nervoso Central (SNC), onde retomou sua proliferação, confirmando a importância da resposta imune adaptativa em conter essa infecção fúngica. Em relação aos aspectos metabólicos analisados, observamos que todos os fungos induziram acidificação extracelular, indicando aumento na realização de glicólise pelos macrófagos, ao mesmo tempo em que o Stat previne o aumento da captação de 2NBDG induzida pelo tratamento com LPS e IFN-γ, possivelmente representando uma estratégia ativa de evitar a ativação pró-inflamatória. Curiosamente, o DCn induz uma maior captura de ácidos graxos por macrófagos pré-tratados com LPS e IFN-γ, apesar de reduzir a dependência dos macrófagos utilizarem essa fonte de energia. Por fim, DCn modulou a expressão de genes relacionados ao metabolismo de glicose e ácidos graxos, apesar de em menor grau do que o Stat. Esses dados demonstram a preferência do DCn pela utilização de lipídeos como fonte de energia e a capacidade de modular o metabolismo do macrófago hospedeiro a seu favor, induzindo o metabolismo glicolítico nos macrófagos.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF).The ability to remain dormant or in a latent state is an adaptation observed in several cells and organisms, in which cells reduce their metabolism, transcription and translation, to remain alive in conditions that are not ideal for their growth. Thus, they resume active growth when the environment returns to favorable conditions. Such adaptation is also observed in Cryptococcus neoformans yeasts, fungus that causes cryptococcal meningitis in immunocompromised patients. In this work we analyzed the mechanisms involved in the reactivation of C. neoformans during in vitro and in vivo infection and the metabolic changes induced by this fungus in infected macrophages. For this, we infected bone marrow-derived macrophages (BMDM), pre-treated or not with LPS and IFN-γ with our model of dormant C. neoformans (DCn), C. neoformans in active growth (Stat) and heat-killed (HK) + 1% Stat and analyzed the ability of DCn to reactivate under these conditions; and also the influence of extracellular vesicles (EV) produced by BMDM. For analysis of cellular metabolism, we analyzed mitochondrial mass, mitochondrial membrane depolarization, production of reactive oxygen species (ROS), indirect glucose and fatty acid capture by flow cytometry. Furthermore, we analyzed the respiratory profile of infected cells by oximetry and used RT-qPCR to quantify the expression of important genes in cellular metabolism. For analysis of reactivation in an in vivo context, we infected wild-type (WT) or “Knockout” (KO) mice for IFN-γ or nitric oxide (NO) expression, with DCn and their respective controls. We then observed that phagocytosis is important to stimulate DCn reactivation, although it is not necessary, since contact with extracellular compounds released by macrophages is enough to induce such reactivation and that this process is inhibited in the presence of LPS and IFN- γ. We also observed that DCn only reactivated in mice immunosuppressed with dexamethasone (C57BL/6) deficient in the production of IFN-γ or in mice immunodeficient in the production of T lymphocytes (Balb/c nude), in which the fungus maintained its virulence and migrated to the Central Nervous System (CNS), where it resumed its proliferation, confirming the importance of the adaptive immune response in containing this fungal infection. Regarding the analyzed metabolic aspects, we observed that all fungi induced extracellular acidification, indicating an increase in the performance of glycolysis by macrophages, while Stat prevents the increase of 2NBDG uptake induced by treatment with LPS and IFN-γ, possibly representing an active strategy to avoid pro-inflammatory activation. Interestingly, DCn induced a greater uptake of fatty acids by macrophages pretreated with LPS and IFN-γ, despite reducing the dependency of macrophages on this energy source. Finally, DCn enhanced the expression of genes related to glucose and fatty acid metabolism, although to a lesser extent than Stat. These data demonstrate DCn's preference for the use of lipids as an energy source and the ability to modulate host macrophage metabolism in its favor, inducing glycolytic metabolism in macrophages.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Departamento de Biologia Celular (IB CEL)Programa de Pós-Graduação em Biologia MolecularBocca, Anamélia LorenzettiCoelho, CarolinaMarina, Clara Luna Freitas2023-10-25T20:49:52Z2023-10-25T20:49:52Z2023-10-252023-02-27info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfMARINA, Clara Luna Freitas. Análise da infecção criptocócica latente e da reativação de células dormentes de cryptococcus neoformans associada ao metabolismo celular de macrófagos. 2023. 106 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular) — Universidade de Brasília, Brasília, 2023.http://repositorio.unb.br/handle/10482/46747porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2025-02-27T17:00:24Zoai:repositorio.unb.br:10482/46747Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2025-02-27T17:00:24Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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