Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2012
Autor(a) principal: Oliveira Neto, Osmar de Souza
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Link de acesso: http://repositorio.unb.br/handle/10482/11030
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Laboratório de Biologia Molecular, 2012.
id UNB_5ce0f209f893e93284050e12028b170b
oai_identifier_str oai:repositorio.unb.br:10482/11030
network_acronym_str UNB
network_name_str Repositório Institucional da UnB
repository_id_str
spelling Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastorisPeptídeosProteínasBiologia molecularDissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Laboratório de Biologia Molecular, 2012.Quase todos os vetores de expressão de Pichia pastoris utilizam a sequência da região pré-pró do fator-α de Saccharomyces cerevisiae como sinal de secreção, o qual pode ser processado incorretamente em condições de hiperexpressão. Utilizar um sinal de secreção nativo de P. pastoris pode contornar este problema, mantendo a estrutura correta da proteína heteróloga. Utilizando o software Signal P. 3.0, os peptídeos sinais de 13 proteínas nativas do secretoma e a região “pré-pró” do fator α putativo de P. pastoris foram identificados e em seguida suas sequências foram amplificadas via PCR. Essas sequências foram clonadas no vetor pPIC9, integradas e expressas nessa levedura, junto com o gene repórter α-amilase de Bacillus subtillis. O fator α de S. cerevisiae presente nesse vetor foi removido, permitindo que apenas as sequências testadas neste trabalho influenciassem a secreção da enzima heteróloga. Após análise dos halos de hidrólise em placa e ensaios enzimáticos utilizando sobrenadante de cultura, observou-se que pelo menos quatro sinais de secreção testados possuíam níveis de secreção semelhantes ao fator α de S. cerevisiae. O sequenciamento do N-terminal da α-amilase será feito por espectrometria de massa, após purificação da enzima em coluna de níquel, e permitirá a análise da eficiência de processamento dos peptídeos sinais testados. Este último teste permitirá a escolha de um novo sinal de secreção nativo de P. pastoris, introduzindo novas opções para expressão heteróloga nesta levedura, além das disponíveis comercialmente pela empresa Invitrogen (EUA). _________________________________________________________________________________ ABSTRACTAlmost all Pichia pastoris expression vectors uses Saccharomyces cerevisiae α-factor secretion signal, which can be improperly processed in conditions of hiperexpression. Using a native P. pastoris secretion signal should overcome this problem, maintaining the right structure of the heterologous protein. Using Signal P. 3.0 software, 13 secretion signals of native secretome proteins and the putative α factor of P. pastoris were identified and then their sequences were amplified via PCR. These sequences were cloned in pPIC9 vector, integrated and expressed in this yeast, along with a Bacillus subtillis α-amylase gene as a reporter. The S. cerevisiae α factor present in this vector was removed, allowing that only the sequences tested in this work had influence on the secretion of the heterologous enzyme. After analyses of hydrolysis halos on plates and enzymatic assays using culture supernatants, it was observed that at least four secretion signals tested had similar secretion levels of the S. cerevisiae α factor. Sequencing of the N-terminus of α-amylase will be carried out by mass spectrometry, after purification of the enzyme in a nickel based column, and will allow analysis of processing efficiency of the signal peptides tested. The latter test will enable the selection of a new native P. pastoris secretion signal, introducing new options for heterologous expression in this yeast, aside the ones commercially available by Invitrogen Company (USA).Torres, Fernando Araripe GonçalvesMoraes, Lídia Maria Pepe deOliveira Neto, Osmar de Souza2012-07-30T12:10:45Z2012-07-30T12:10:45Z2012-07-302012-03-29info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfOLIVEIRA NETO, Osmar de Souza. Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris. 2012. vii, 70 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2012.http://repositorio.unb.br/handle/10482/11030info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-13T20:52:10Zoai:repositorio.unb.br:10482/11030Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-13T20:52:10Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
dc.title.none.fl_str_mv Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris
title Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris
spellingShingle Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris
Oliveira Neto, Osmar de Souza
Peptídeos
Proteínas
Biologia molecular
title_short Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris
title_full Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris
title_fullStr Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris
title_full_unstemmed Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris
title_sort Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris
author Oliveira Neto, Osmar de Souza
author_facet Oliveira Neto, Osmar de Souza
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Torres, Fernando Araripe Gonçalves
Moraes, Lídia Maria Pepe de
dc.contributor.author.fl_str_mv Oliveira Neto, Osmar de Souza
dc.subject.por.fl_str_mv Peptídeos
Proteínas
Biologia molecular
topic Peptídeos
Proteínas
Biologia molecular
description Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Laboratório de Biologia Molecular, 2012.
publishDate 2012
dc.date.none.fl_str_mv 2012-07-30T12:10:45Z
2012-07-30T12:10:45Z
2012-07-30
2012-03-29
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv OLIVEIRA NETO, Osmar de Souza. Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris. 2012. vii, 70 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2012.
http://repositorio.unb.br/handle/10482/11030
identifier_str_mv OLIVEIRA NETO, Osmar de Souza. Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris. 2012. vii, 70 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2012.
url http://repositorio.unb.br/handle/10482/11030
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Institucional da UnB
instname:Universidade de Brasília (UnB)
instacron:UNB
instname_str Universidade de Brasília (UnB)
instacron_str UNB
institution UNB
reponame_str Repositório Institucional da UnB
collection Repositório Institucional da UnB
repository.name.fl_str_mv Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)
repository.mail.fl_str_mv repositorio@unb.br
_version_ 1839083986227298304