Validação da estabilidade de estruturas de dsRNA para uso no silenciamento gênico de insetos-praga : avaliação na planta e no inseto alvo

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2015
Autor(a) principal: Garcia, Rayssa Almeida
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Algodão - doenças e pragas
Bicudo-do-algodoeiro
Silenciamento gênico
Controle de pragas
Link de acesso: http://repositorio.unb.br/handle/10482/18462
http://dx.doi.org/10.26512/2015.02.D.18462
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015.
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spelling Validação da estabilidade de estruturas de dsRNA para uso no silenciamento gênico de insetos-praga : avaliação na planta e no inseto alvoAlgodão - doenças e pragasBicudo-do-algodoeiroSilenciamento gênicoControle de pragasDissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015.Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: capítulos I, II e III.O algodão é uma das principais commodities da economia brasileira, alavancando o País ao posto de quinto maior produtor mundial. Entre as diferentes pragas da cotonicultura, o bicudo-do-algodoeiro é o inseto-praga mais destrutivo. Pela biotecnologia, um dos métodos alternativos de controle de insetos-praga é o silenciamento gênico, por meio do RNA interferente. Contudo, em insetos, absorção do RNA fita dupla (dsRNA) produzidos por plantas é dificultada, principalmente em decorrência da clivagem do dsRNA na planta e da ação de nucleases presentes no intestino dos insetos. Assim, os objetivos do presente estudo foram estudar o papel de nucleases intestinais de Anthonomus grandis na degradação do dsRNA e aumentar a estabilidade das moléculas de dsRNA. Primeiramente, a atividade nucleásica ácida foi detectada no homogenato intestinal de A. grandis. Por meio da busca no transcritoma de A. grandis foram encontradas três contigs codificadores de nucleases, denominados AgNuc1, AgNuc2 e AgNuc3, cujas sequências foram caracterizadas e validadas por RNAi. As três sequências apresentaram similaridade acima de 50 % em relação às outras nucleases de insetos. A análise por qPCR demonstrou que AgNuc2 e AgNuc3 foram altamente expressas no intestino de A. grandis. O silenciamento específico de AgNuc2 culminou na redução da degradação do dsRNA; demonstrando ser a principal nuclease associada à degradação de dsRNA no lúmen intestinal de A. grandis. Além disso, visando aumentar a estabilidade do dsRNA, foram desenhados dsRNAs, baseados na arquitetura de viróide, que são resistentes à ação de nucleases. A análise do movimento de dsRNA-viróide marcado com Cy3 no sistema vascular de Arabidopsis thaliana demonstrou uma localização celular específica para a estrutura do dsRNA. O dsRNA baseado na arquitetura da família Pospiviroidae, foi localizado no núcleo das células, enquanto que o dsRNA, baseado na arquitetura da família Avsunviroidae, foi localizado nos cloroplastos das células. Os dsRNAs estabilizados mostraram uma capacidade de silenciamento gênico 8 vezes superior, quando comparado ao dsRNA linear não estruturado Os dados aqui gerados contribuem para o conhecimento do mecanismo de RNAi em insetos e demonstram que as moléculas de dsRNA estabilizados apresentam grande potencial para a aplicabilidade da tecnologia do RNAi visando o controle de insetos-praga.Cotton is one of the most important Brazilian commodities and Brazil is the fifth largest world producer. Nonetheless, productivity is constantly crippled by a variety of agricultural pests. Among the different cotton insect pests, cotton boll weevil is the most destructive. By using biotechnology strategies, one of the alternative methods for controlling crop pests is gene silencing through RNA interference. However, in insects, the absorption of double stranded RNA produced by plants is hampered due to dsRNA cleavage in plants tissues and due to the presence of insect gut nucleases. In this context, the objects of this study were to investigate the dsRNA degradation by Anthonomus grandis gut nucleases and improve the stability of dsRNA. Nucleasic activity was detected in A. grandis intestinal homogenate. After searching in A. grandis transcriptome, three contigs codifying nucleases were found, called AgNuc1, AgNuc2 and AgNuc3, whose sequences were characterized and validated by RNAi. The three sequences showed similarity above 50% when compared to other insect nucleases. qPCR analysis showed that AgNuc2 and AgNuc3 are highly expressed in A. grandis midgut. AgNuc2 gene silencing resulted on reduction of dsRNA degradation; thereby, we concluded that AgNuc2 is the main nuclease associated with dsRNA degradation in A. grandis gut lumen. Additionally, in order to increase dsRNA stability, dsRNA with viroid architecture were designed, wich are resistant to plant nucleases. Viroid-dsRNA were marked with Cy3 and analysed regarding their movement in A. thaliana vascular system, wich showed that they are adressed to a specif cellular localization. dsRNA based on Pospiviroidae family architecture was located on cell nuclei while dsRNA based on Avsunviroidae family was located in chloroplasts. Moreover, these stabilized dsRNAs showed high gene silencing activity, eight times higher than linear dsRNA. The data here generated contribute to our understandings of RNAi mechanisms in insects and show that stabilized dsRNAs exhibit great pontential in RNAi applicability aiming crop insect pest control.Sá, Maria Fátima Grossi deGarcia, Rayssa Almeida2015-07-20T12:06:44Z2015-07-20T12:06:44Z2015-07-202015-02-13info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfGARCIA, Rayssa Almeida. Validação da estabilidade de estruturas de dsRNA para uso no silenciamento gênico de insetos-praga: avaliação na planta e no inseto alvo. 2015. 112 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2015.http://repositorio.unb.br/handle/10482/18462http://dx.doi.org/10.26512/2015.02.D.18462A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-13T20:52:03Zoai:repositorio.unb.br:10482/18462Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-13T20:52:03Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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