Estudo do equilibrio liquido-liquido, da partição de insulina e da pre-purificação da proteina de fusão precursora da insulina humana em sistemas aquosos bifasicos do tipo PEG/Sal

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2003
Autor(a) principal: Alves, Jose Guilherme Lembi Ferreira
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: [s.n.]
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Equilíbrio líquido-líquido
Modelagem
Insulina
Polietileno
Liquid-liquid equilibrium
Modeling
Insulin
Polyethylene
Link de acesso: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1594010
Resumo: Orientador : Antonio Jose de Almeida Meirelles
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Os experimentos de partição da proteína de fusão foram conduzidos de forma a identificar condições para a separação da proteína de fusão de outras proteínas e componentes celulares de E. coli. Foram realizados dois planejamentos experimentais 32 para o estudo da partição da proteína de fusão precursora da insulina humana no sistema PEG/fosfato de potássio/água. tendo-se como variáveis a massa molar do polietileno glicol, a razão mássica PEG/fosfato do sistema (RPEG/FOS). OS níveis estudados foram 1500, 3350 e 8000 para a massa molar do PEG; 1,6, 1,636 e 1,67 para RPEG/FOS. No primeiro planejamento, os testes de partição foram conduzidos a pH 9, enquanto que no segundo planejamento, os testes foram conduzidos a pH 12. Concluídos os testes com o sistema PEG/fosfato de potássio/água, foi escolhida a melhor condição para a purificação da proteína de fusão, condição esta que foi também testada para o sistema PEG/citrato de sódio/água. Para o sistema PEG/fosfato de potássio/água, o melhor resultado foi obtido com o PEG de massa molar 1500, concentração de 16% p/p PEG/l0% p/p de fosfato e pH 9, com fator de purificação da ordem de 1,5 vez e recuperação de 99%. Nestas mesmas condições, mas utilizando citrato de sódio, o fator de purificação e a recuperação foram 1,8 vez e 50,0%, respectivamente. Para analisar a proteína de fusão precursora da insulina humana, desenvolveu-se uma metodologia de análise por Cromatografia de afinidade / FPLC, usando-se a coluna Chelating Sepharose para separar a proteína de fusão dos demais componentes celulares e o Método de Bradford para quantificá-1a. Diagramas de fase do sistema PE& Na3Cit/H2O, para 3 pesos moleculares de PEG (600, 1500 e 3000) foram medidos a 25°C e modelou-se o equilíbrio líquido-líquido deste sistema usando-se o modelo VERS, baseado na equação do virial e que usa como medida de concentração uma fração de superfície externa do componente. Um ajuste muito bom aos dados experimentais foi obtido e os erros absolutos médios entre as concentrações experimentais dos componentes e as calculadas pelo modelo VERS foram 1,16%, 1,05% e 1,19% para os sistemas PEG600/ Na3Cit/H2O, PEGl500/ Na3Cit/H2O e PEG3000/ Na3Cit/H2O, respectivamente. O modelo obtido apresentou boa capacidade preditiva para a influência da massa molar do PEG sobre o equilíbrio líquido-líquido do sistema estudado. Para fins de modelagem termodinâmica, também foi estudada a partição das insulinas humana e suína puras nos sistemas PEG600/ Na3Cit/H2O, PEG1450/Na3Cit/ H2O e PEG3350/Na3Cit/ H2O em pH 4,5, 7 e 9,5 a 25°C para modelar a partição da insulina no sistema PEG/ Na3Cit/ H2O, utilizando-se também o modelo VERS e bons resultados foram obtidos para a -predição do coeficiente de partição da insulina suína no sistema PEG/ Na3Cit/H2O a pH 7,0Abstract: In this work the primary purification of a fusion protein precursor of human insulin and produced by recombinant E. coli has been studied using aqueous two-phase systems. The fusion protein was provided by the pharmaceutical company Biobrás S.A (Montes Claros/Brazil) and was dissolved in 8M area. Partitioning essays of fusion protein were investigated in the poly(ethylene glycol) (PEG)/potassium phosphate and poly(ethylene glycol)/sodium citrate aqueous two-phase systems at 25°C. Two 32 experimental design were done to evaluate the effects of PEG molecular weight and the polymer/salt concentration ratio on the purification factor and on the recovery of the fusion protein in the top phase. The studied levels were 1500, 3350 and 8000 for PEG molecular weight and 1,6; 1,636 and 1,67 for the polymerlsaIt concentration ratio. The partitioning experiments were performed at pH 9 and 12. An analytical method for the fusion protein was developed using Immobilized Metal Affinity Chromatography and the Bradford method. Solids on the interface top were observed in all cases examined The fusion protein partitioned between the PEG-rich phase and the solids on interface. Contaminating proteins were eliminated to some extent, which resulted in an almost 2-fold fusion protein purification with good recoveries. Phase diagrams of the system poly(ethylene glycol)1 sodium citrate/water were determined for three different molecular weights of PEG ( 600, 1500, 3000) at 25°C. At least four tie-lines of each system were measured. The experimental results were correlated by applying a model for the excess Gibbs energy. This model is the Virial equation used by Pitzer for salt solutions, but concentrations are expressed by surface fraction. It is called Virial Equation with Relative Surface fractions (VERS). All phase equilibrium calculations were performed using this model and minimizing the Gibbs energy of the feed under the constraint that both phases are electroneutral. Agreement between the experimental and calculated results within the experimental uncertainty was obtained. The average percents of deviation between experimental and calculated values using VERS model for all components were 1,16%, 1,05% and 1,19% for the systems PEG6001 Na3Cit/H2O, PEGl500/ Na3Cit/H2O PEG30001 Na3Cít/ H2O respectively. Human and porcine insulin partitioning was investigated in the system PEG/sodium citrate/water for three pHs (4,5; 7 and 9,5) at 25°C. Human and porcine insulin showed great affinity for the PEG-rich phase and the partition coefficients were higher than 10. The human insulin partition coefficient is practically independent of the PEG molecular mass. However, there is a tendency for the porcine insulin partition coefficient to increase with the PEG molecular mass at pH 7 and 9,5, attaining values- above 50. The porcine insulin partition coefficient was predicted in the system PEG/sodium citrate/water at 25°C using VERS model and good results were obtained for the system at pH 7DoutoradoMestre em Engenharia de Alimentos[s.n.]Meirelles, Antonio José de Almeida, 1958-Pessoa Junior, AdalbertoCoimbra, Jane Selia dos ReisAznar, MartínMohamed, Rahoma SadegUniversidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de AlimentosPrograma de Pós-Graduação em Engenharia de AlimentosUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASAlves, Jose Guilherme Lembi Ferreira20032003-03-24T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf192p. : il.(Broch.)https://hdl.handle.net/20.500.12733/1594010ALVES, Jose Guilherme Lembi Ferreira. Estudo do equilibrio liquido-liquido, da partição de insulina e da pre-purificação da proteina de fusão precursora da insulina humana em sistemas aquosos bifasicos do tipo PEG/Sal. 2003. 192p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1594010. 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