Clonagem e expressão Datransposase mos1 de Drosophila simulans e o desenho in silico de um vetor para expressão heteróloga de proteínas

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Tapia, Jéssica Silva
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal do Pampa
• Palavras-chave em Inglês: Drosophila; DNA; Gene Cloning
• Link de acesso: http://dspace.unipampa.edu.br/jspui/handle/riu/1464

A importância da expressão de proteínas de forma heteróloga tem crescido surpreendentemente, tendo em vista a progressiva necessidade de sua produção para aplicações na indústria farmacêutica, para uso terapêutico, ou uso comerciais, e estudo de estrutura e função. No entanto, a expressão das proteínas pode ser limitada por diversos fatores, podendo apresentar diversas dificuldades como a formação de corpos de inclusão ou proteínas com conformação incorreta, por exemplo. Estudos em hospedeiro para expressão de proteínas heterólogas tem sido desenvolvido, a fim de otimizar fatores como temperatura e concentração de indutor, com o intuito de melhorar a qualidade das proteínas obtidas. Neste estudo, inicialmente objetivou-se otimizar a expressão da transposase do elemento mariner mos1, em diferentes cepas de Escherichia coli BL21(DE3), E. coli BL21 (DE3) pLysS, E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RP; E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL; E. coli BL21(DE3) pT-GROE, usando para subclonagem o vetor plasmidial de expressão pGEX-4T1. Analisando o melhor sistema de expressão para este elemento em particular, comparando as temperaturas de 30°C e 37°C para expressão e utilizando concentrações de 0,1mM; 0,5mM e 1,0mM de IPTG. Mesmo obtendo sucesso na expressão, com todas as condições de IPTG e em ambas as temperaturas testadas, o sistema de expressão não foi eficaz para obter proteínas de forma solúvel. Frente a este problema procuramos desenvolver um vetor de expressão de proteínas heterólogas que afim de tornar este processo mais rápido e mais eficiente, utilizando apenas um evento de clonagem e de transformação da bactéria de expressão. O vetor para expressão foi desenhado in silico a partir de um promotor Lac responsivo a IPTG, seguido por um sinal de exportação celular (peptídeo-sinal), um fragmento Strep-tagII para purificação e um sítio para trombina, permitindo a clivagem da proteína de interesse dos tags fusionados. Foram inseridos dois sítios para endonucleases de restrição (BamHI e XbaI) que permitem a clivagem do gene clonado no constructo. Desta forma demonstramos que todas as cepas foram eficazes na expressão da transposase mos1, sendo a temperatura mais adequada de 37°C em todas as concentrações de IPTG, já que não houve nenhuma diferença quanto a mudança deste fator. Apresentamos um novo vetor de expressão de proteínas heterólogas, com a finalidade de facilitar a obtenção de proteínas heterólogas purificadas, tais problemas encontrados durante a tentativa de expressão da transposase.