Elucidação estrutural da especificidade por substratos de enzimas da biossíntese de aminoglicosídeos e marginolactonas

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Cardoso, Tábata Peres
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Enzimas; Estrutura; Aminoglicosídeos; Marginolactonas; Enzymes; Aminoglycoside antibiotics; Marginolactone; Structure
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/193031

Os produtos naturais desempenham um papel importante no desenvolvimento de medicamentos e parte desse sucesso está relacionado com a diversidade química e estrutural apresentadas pelos compostos dotados de relevância biológica. Um exemplo de produtos naturais oriundos do metabolismo secundário de microrganismos são os antibióticos aminoglicosídicos e policetídicos. A complexidade estrutural implica em dificuldades para produzir análogos com atividades medicinais melhoradas. Por outro lado, a biossíntese combinatorial explora a promiscuidade de substratos e emprega enzimas e vias modificadas para produzir novos produtos "não naturais". No presente trabalho, buscamos elucidar estruturalmente enzimas envolvidas na biossíntese de aminoglicosídeos (NeoB, NeoQ, ParB, ParQ, LivB e LivQ) e policetídeos marginolactonas (AMH_821, AMH_828, Medi_4948) com aplicação biotecnológicas. Para isso, genes foram clonados e expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes foram purificadas. Para as proteínas NeoQ e ParQ, foram realizados teste de expressão a fim de encontrar uma condição de maior rendimento proteico. Para a proteína NeoB, foi realizado um ensaio de deslocamento térmico para escolha do melhor tampão para purificação. Cristais das proteínas NeoB, AMH_828, Medi_4948 foram obtidos em diferentes condições. Aplicamos métodos de resolução estrutural por substituição molecular para todas as proteínas estudadas. Foram resolvidas as estruturas das proteínas NeoB e Medi_4948. A estrutura da enzimaMedi_4948 possui um enovelamento característicos de α/β hidrolases, compartilhado por ureohidrolases e foi possivel observar que ela é hexamêrica, composta por dois trímeros. Esta proteína contém uma alça flexível na região do N-terminal o qual interage com a unidade subjacente do monomero vizinho. O sítio ativo apresenta um cluster binuclear para um íon metal, o qual, juntamente com uma molécula de água é importante para a catálise. A enzima NeoB revelou uma estrutura que contém contém 12 fitas-β e 11 α-hélices. Sete fitas-β formam uma folha-β mista que é bem característico dos membros da superfamília das aspartato aminotransferases. Foi possível também observar um motivo grampo β. Nós mostramos as primeiras informações estruturais obtidas sobre a amidinohidrolase Medi4948 e também conseguimos resultados para outra enzima, uma aminotransferase da biossíntese de neomicina, Neo B.