Descrição e avaliação funcional de um novo subtipo de TccP (Tir cytoskeleton coupling protein) na formação da lesão attaching and effacing, independentemente de Nck, em um isolado de Escherichia albertii

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Fernandes, Iranildo do Amarante [UNESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: E. albertii; Lesão AE; Virulência; TccP4
• Link de acesso: https://hdl.handle.net/11449/253210

A espécie Escherichia albertii compreende o mais novo membro do gênero Escherichia e é responsável por casos esporádicos, bem como surtos de diarreia em diversos países do mundo, incluindo o Brasil. Uma das principais características de virulência observada em isolados classificados como pertencentes à espécie E. albertii é a formação da lesão attaching and effacing (AE), que é caracterizada pela aderência íntima da bactéria às células epiteliais, destruição das microvilosidades e formação de uma estrutura semelhante a um pedestal rico em F-actina e outros elementos do citoesqueleto eucariótico. Estudos anteriores, realizados com o protótipo brasileiro de E. albertii 1551-2, mostraram que esse patógeno possui a capacidade de recrutar F-actina para a formação da lesão AE utilizando tanto a via Nck-dependente, que requer a fosforilação do resíduo de Tirosina Y474 na proteína receptora Tir, quanto a via Nck-independente, que utiliza a proteína adaptadora TccP (Tir-cytoskeleton coupling protein). Estudos anteriores identificaram um novo subtipo de TccP no isolado de E. albertii 1551-2 (denominado TccP3), cujo papel na formação da lesão AE se mostrou minoritário. Análises posteriores do genoma do isolado de E. albertii 1551-2 revelaram que, além de TccP3, esse isolado alberga um gene com potencial para codificar um novo TccP. Frente ao exposto, nossos objetivos foram avaliar a relação desse novo TccP com os subtipos de TccP já descritos até o momento, bem como a participação dessa nova proteína na formação da lesão AE pela via independente de Nck. Uma árvore de máxima verossimilhança foi construída comparando as sequências de aminoácidos dos diferentes subtipos de TccP e a sequência do novo TccP encontrado no isolado 1551-2. Posteriormente, foram realizadas a mutagênese e complementação in trans do gene responsável por codificar essa nova proteína a partir do mutante 1551-2tccP3. Sequenciamento Sanger e Immunoblotting foram realizados para confirmação da mutagênese e complementação, respectivamente. Em desfecho, foram realizados testes quantitativos de FAS (Fluorescent actin staining) em células MEF (Mouse Embrionic Fibroblast) desprovidas de Nck e infectadas com as bactérias empregadas neste estudo. A nova proteína TccP identificada nesse estudo, está localizada em um clado diferente na árvore de máxima verossimilhança e apresentou identidade inferior a 80% se comparada com outros subtipos de TccP. Tais resultados indicam, portanto, se tratar de um novo subtipo de TccP, denominado neste estudo de TccP4. A deleção do gene tccP4 foi confirmada por sequenciamento bem como pela produção da proteína recombinante TccP4-Myc no isolado complementado por Immunoblotting com o soro anti-Myc. Os testes quantitativos mostraram que 64,7% das bactérias selvagens aderidas eram capazes de recrutar F-actina para a formação do pedestal característico da lesão AE, enquanto, apenas 5,0% dos isolados de E. albertii mutados em tccP4 (1551-2tccP3/tccP4) mostraram esse fenótipo, sendo essa diferença considerada significativa pelo teste de ANOVA (P < 0.0001). A complementação in trans restaurou a capacidade do isolado 1551-2tccP3/tccP4 (pTccP4) em recrutar F-actina em porcentagens semelhantes às observadas com o isolado selvagem (64,7% vs. 52,6%; P = 0.3846). Tais evidências vêm a corroborar o papel da proteína adaptadora TccP4 no recrutamento de F-actina, pela via Nck-independente, para a formação da lesão AE durante o estabelecimento do processo infeccioso por E. albertii.