Avaliação funcional das proteínas desacopladoras mitocondriais em Arabidopsis thaliana utilizando mutantes de inserção

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Lima, Rômulo Pedro Macêdo [UNESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Proteína desacopladora; Mitocôndrias; Expressão gênica; Mutagênese insercional; Metaboloma; Proteínas de desacoplamento mitocondrial; Uncoupling protein; Mitochondria; Double mutant; Gene expression and metabolome
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/235017

As proteínas desacopladoras mitocondriais (UCPs) são proteínas especializadas no transporte mitocondrial capazes de dissipar o gradiente eletroquímico de prótons gerados na respiração independente da síntese de ATP. Essas proteínas fazem parte da família de carreadores aniônicos mitocondriais e desempenham um papel fundamental na manutenção da função mitocondrial. Em plantas, a importância das UCPs como componentes da tolerância celular ao estresse oxidativo já foi demonstrada em estudos prévios. Três genes codificando UCP já foram descritos em Arabidopsis thaliana (nomeados AtUCP1-3), sendo boa parte dos dados funcionais obtidos para a isoforma AtUCP1. Portanto, o papel desempenhado pelas demais isoformas é ainda pouco estudado. Diante disso, mutantes de inserção de arabidopsis foram empregados para investigar a existência de redundância funcional entre essas isoformas. Para tal, numa primeira abordagem, duplo-mutantes de inserção para diferentes combinações gênicas (atucp1/atucp2, atucp1/atucp3 e atucp2/atucp3) foram obtidos e analisados funcionalmente durante o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo. Em uma segunda etapa foram empreendidas análises de metabólitos durante a fase vegetativa destes duplo-mutantes. Em paralelo, baseado em dados prévios da primeira abordagem que indicaram fenótipos mais evidentes na fase vegetativa do duplo-mutante atucp1/atucp3 em relação ao controle selvagem, o perfil global de expressão gênica deste duplo-mutante na fase vegetativa foi determinado usando RNA-Seq. Análises subsequentes de bioinformática com datasets encontrados na literatura foram empreendidas. Os dados obtidos na primeira etapa indicam que as três isoformas parecem atuar de forma complementar em diferentes processos associados ao crescimento e desenvolvimento de A. thaliana. As isoformas AtUCP1 e AtUCP2 atuariam de forma conjunta na manutenção da homeostase e função mitocondrial durante a fase reprodutiva. Por outro lado, as isoformas AtUCP2 e AtUCP3 teriam maior relevância funcional na atividade fotossintética, enquanto que a AtUCP1 atuaria na manutenção do aparato fotossintético. Além disso, as isoformas AtUCP2 e AtUCP3 atuariam em conjunto na manutenção do equilíbrio redox. Os dados indicam ainda que todas as três isoformas atuam em conjunto para a redução das espécies reativas de oxigênio (ERO) na mitocôndria. Cabe ressaltar que o duplo knockdown dos genes AtUCP1 e AtUCP3 foi o que promoveu as maiores alterações fenotípicas e de função mitocondrial na fase vegetativa. Curiosamente, uma maior atividade respiratória foi registrada no duplo-mutante atucp2/atucp3, o que pode ser justificado pela forte expressão compensatória do gene AtUCP1 sob condições normais. De maneira similar, uma forte expressão compensatória da isoforma não inativada foi detectada em todas as três combinações de duplo-mutantes crescidos em condições normais ou em presença de estresse (salino e osmótico), o sugerindo uma redundância parcial entre elas. As análises de metabólitos revelaram profundas alterações no teor de alguns metabólitos primários (açúcares, aminoácidos, ácidos orgânicos e componentes de ácidos nucléicos) e secundários nos três duplo-mutantes. Em consonância, diversos genes diferencialmente expressos associados ao cloroplasto, mitocôndria e à resposta aos estresses abióticos foram detectados no duplo-mutante atucp1/atucp3. As análises comparativas de RNA-Seq para validação com o dataset selecionado de A. thaliana tipo selvagem reforçam os impactos causados por toda a célula. Em conjunto, os resultados obtidos evidenciaram uma intensa reprogramação transcricional e metabólica em decorrência do duplo Knockdown de genes AtUCP1 and AtUCP3. As análises apontaram ainda para a existência de uma redundância funcional parcial entre as três isoformas, que atuariam ora de forma isolada, ora de maneira conjunta na manutenção da homeostase e função mitocondrial durante o crescimento e desenvolvimento de A. thaliana. Essas descobertas fornecem novos subsídios para fundamentar o papel desempenhado pelas diferentes isoformas e fornecem insights sobre a atuação in planta da isoforma AtUCP3 em associação com a AtUCP1.