Determinação estrutural e busca por inibidores da enzima desoxi-hipusina sintase de organismos eucarióticos causadores de doenças negligenciadas

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Klippel, Angélica Hollunder [UNESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: eIF5A; desoxi-hipusina sintase; doenças tropicais negligenciadas; leishmaniose; descoberta de fármacos; deoxyhypusine synthase; neglected tropical diseases; leishmaniasis; drug discovery
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/242596

O fator de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é altamente conservado em eucariotos e essencial para a proliferação celular. eIF5A é modificado pós-traducionalmente através de uma reação muito específica, chamada hipusinação, a qual é necessária para sua função. A hipusinação ocorre em duas etapas, envolvendo as enzimas desoxi-hipusina sintase (DHPS) e desoxi-hipusina hidroxilase (DOOH). Considerando a essencialidade da hipusinação e de eIF5A, a DHPS e a DOOH correspondem a alvos interessantes para o desenvolvimento de fármacos para inibir a proliferação de vários organismos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é determinar a estrutura tridimensional e buscar inibidores para as DHPSs dos seguintes organismos causadores de doenças tropicais negligenciadas: Paracoccidioides brasiliensis (Pb), Histoplasma capsulatum (Hc), Brugia malayi (Bm) e Leishmania sp. (duas isoformas: A e B). Para tanto, foram padronizadas as condições de clonagem, produção em Escherichia coli e purificação dessas proteínas. Isso possibilitou o estabelecimento de um ensaio bioquímico fácil de ser miniaturizado para a HcDHPSA, BmDHPSA e PbDHPSA, e a determinação da estrutura cristalográfica da BmDHPSA e da HcDHPSA. No entanto, essas estruturas apresentam uma arquitetura muito similar à da enzima humana (HsDHPS), o que dificulta o desenvolvimento de inibidores seletivos para as DHPSs desses patógenos. Portanto, novos esforços foram direcionados para a obtenção das Leishmania sp. DHPSs na forma solúvel a partir de E. coli, visto que essas enzimas provavelmente formam um heterocomplexo, diferentemente da HsDHPS. Após combinar uma série de estratégias, as DHPSs de L. donovani (LdDHPSAB) e de L. major (LmDHPSAB) foram produzidas na forma solúvel e ativa a partir de E. coli, o que permitiu a realização de um high-throughput drug screening in vitro com a LdDHPSAB, empregando a reação parcial das DHPSs acoplada ao ensaio NAD+/NADH-Glo™. Dos 26771 compostos testados inicialmente a 10 μM, 44 compostos (hits) inibiram a atividade da LdDHPSAB em mais de 60%. Uma triagem secundária confirmou que 24 (57%) dos hits exibiram efeitos inibitórios consistentes (maior do que 60%) sobre a atividade da LdDHPSAB. Depois de excluir os hits que também inibiram a atividade das enzimas do ensaio NAD+/NADH-Glo™, os 13 compostos restantes foram analisados quanto à concentração-resposta empregando o mesmo ensaio acoplado. Nove desses 13 compostos apresentaram um IC50 contra a atividade da LdDHPSAB na faixa micromolar baixa. Dentre esses, os compostos MMV1674024 e MMV904563 apresentaram um maior potencial para futuras otimizações com o intuito de melhorar a potência de inibição sobre a atividade das Leishmania sp. DHPSs. Além disso, os dados de inibição in vitro sugerem que a inibição das Leishmania sp. DHPSs sem afetar a atividade da HsDHPS corresponde a uma tarefa viável, confirmando a hipótese de que a DHPS é um alvo interessante para ser explorado em Leishmania sp. Ainda, empregando o ensaio baseado na detecção da fluorescência do NADH, foi possível determinar que o composto MMV1674024 exerce uma inibição sobre a atividade da LmDHPSAB do tipo mista em relação ao NAD+ e à espermidina. Finalmente, foram obtidos cristais para a LmDHPSAB preparada na presença de NAD+ e do composto MMV1674024. Entetanto, esses cristais não difrataram durante a coleta de dados de difração por raios X, mesmo após tentativas de otimização das condições de cristalização.