Estudos moleculares e de interação com Cumarina (1,2-Benzopirona) da proteína Grb2 e seus mutantes Grb2 W121A e Grb2 W60A

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Tedesco, Jéssica Andrade
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Grb2; Cumarina; pH; Flexibilidade proteica; Dimerização proteica; Coumarin; Protein flexibility; Protein dimerization
• Link de acesso: https://hdl.handle.net/11449/251040

O desenvolvimento do câncer envolve uma série de alterações genéticas e epigenéticas que permitem o escape do controle homeostático das células, suprimindo inapropriadamente a proliferação e inibição da sobrevivência de células. Uma das alterações é a elevação do pH intracelular por volta de 7.0 para 8.0. A proteína adaptadora Grb2 está largamente envolvida em uma variedade de carcinomas devido ao seu papel crucial em vias de sinalização responsáveis pelo crescimento e proliferação celular. Propõe-se, então, neste estudo caracterizar possíveis mudanças conformacionais e dinâmicas da proteína Grb2 WT relacionada à modificação do pH e a importância dos triptofanos 60 e 121 localizados no domínio SH2 através de mutações pontuais por alanina. As proteínas Grb2 WT e W60A apresentaram estrutura predominante em dímero, enquanto W121A apresenta uma prevalência da estrutura monomérica. As estruturas diméricas apresentam um aumento do diâmetro hidrodinâmico dependentes do aumento do pH. Para Grb2 WT, este aumento do diâmetro acompanha um aumento de estruturas desordenadas, conferindo uma maior flexibilidade para a proteína. No caso de Grb2 W60A, observou-se um aumento de hélices ɑ e folhas β, sendo que a primeira ocupa um volume maior do que a segunda, corroborando com os dados de DLS, e conferindo maior estabilidade para o pH 8.0. O monômero de Grb2 com a mutação W121A, ainda não relatado na literatura, apresenta um diâmetro estável com variação de 0.1 nm entre os pHs e sem alteração significativa de sua estrutura secundária dependente do aumento de pH. A molécula de Cumarina tem recebido muita atenção na última década devido às suas propriedades anticancerígenas, embora faltem estudos à nível molecular. Um estudo conduzido por Sanches et al. (2019) caracterizou a interação com a proteína Grb2 em pH 8.0 através da técnica de Espectroscopia de Fluorescência com excitação em 290 nm, a qual pode apresentar contribuições significativas da excitação de Tirosinas. Desta forma, optou-se pela caracterização da interação entre as moléculas e as estruturas diméricas WT e W60A em ambos os pHs com excitação em 295 nm. Ambas as interações são espontâneas e governadas por contribuições hidrofóbicas, com constante de associação na ordem de 10^4 M^-1. As constantes de Hill para ambas as proteínas demonstram uma interação com cooperatividade negativa em pH 7.0 (nH~0.7) e não cooperativa para pH 8.0 (nH~1.0). A diferença de interação entre as proteínas se caracteriza pelo fato do mecanismo de supressão em pH 7.0 ser estático para a wildtype e dinâmico para W60A. De forma geral, a semelhança entre as interações da proteína Grb2 WT e Grb2 W60A indica que a cumarina apresenta sítio de interação próximo ao triptofano 121, como proposto por Sanches et al. (2019) através de análises computacionais. Quanto à estrutura secundária das proteínas, a molécula de Cumarina apresenta uma tendência de ordenação, apresentando um aumento de folhas β para a proteína Grb2 WT e de ɑ hélices para Grb2 W60A. Os resultados apresentados podem ser essenciais para o entendimento de possíveis mecanismos de restauração de sinais aberrantes em vias de sinalização provocados pela basificação do meio intracelular, além de aumentar o entendimento da interação da molécula de Cumarina e comprovar a importância do triptofano 121 no processo de dimerização da proteína Grb2 WT.