Caracterização funcional da quinase inositol polifosfato (IP6K) de Leishmania braziliensis

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Ferri, Yete Gambarini [UNESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Pirofosfatos de inositol; Pirofosforilação; Proteínas recombinantes; Leishmania braziliensis; Tripanossomatídeos; Difosfatos; Fosfatos de Inositol
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/242686

Em eucariotos modelo, pirofosfatos de inositol (PP-IPs) – principalmente os chamados IP7 e IP8 – estão envolvidos em uma ampla gama de processos celulares, como regulação do comprimento dos telômeros e recombinação homóloga (HR). No entanto, as proteínas-alvo dos PP-IPs, assim como seu mecanismo de ação, ainda não estão bem estabelecidas. IP7 e IP8 são sintetizados através de vias complementares que envolvem a participação das quinases IP6K e PP-IP5K. Tripanossomatídeos (e.g., Leishmania spp. e Trypanosoma spp.) possuem um gene ortólogo para IP6K, mas aparentemente não possuem ortólogos para PP-IP5K, i.e., teoricamente não sintetizam IP8, o que os torna excelentes modelos para o estudo de IP7. Este projeto consistiu em caracterizar funcionalmente a quinase IP6K de Leishmania braziliensis (LbrIP6K). Além disso, também realizamos a caracterização da quinase IP5K, a qual será utilizada como controle em ensaios futuros. Para isso, realizamos análises in silico utilizando o banco de dados TritrypDB. Encontramos os genes IP6K (LbrM.14.0340) e IP5K (LbrM.20.3290) e desenhamos primers para amplificação dos mesmos a partir do DNA genônico de L. braziliensis. No caso de LbrIP6K, amplificamos seu sítio catalítico (LbrIP6Kdomain). Adicionamos sítios para enzimas de restrição nas extremidades 5’ de cada primer para permitir posterior subclonagem direcional. Os produtos de PCR (amplicons) foram purificados, clonados em vetor de clonagem, inseridos por transformação em bactérias competentes E. coli, selecionados na presença de X-gal/IPTG, multiplicados e recuperados através de extração plasmidial. Realizamos a confirmação da clonagem por PCR e digestões enzimáticas. Em seguida, LbrIP6Kdomain e LbrIP5K foram excisados do plasmídeo utilizando enzimas de restrição específicas e subclonados direcionalmente no vetor de expressão pET28a+. O produto desta ligação foi transformado em bactérias competentes E. coli (cepas BL21-CódonPlus (DE3)-RP e Arctic Express RIL) para posterior expressão induzida por IPTG. As expressões de LbrIP6Kdomain e LbrIP5K foram analisadas em SDS-PAGE e confirmada por Western Blot utilizando anticorpos α-His-Tag. Os resultados demostraram que essas quinases são expressas na fração insolúvel do extrato bacteriano quando lisadas utilizando sonicação. Porém, ao lisar as células por alta pressão (French-press), conseguimos solubilizá-las parcialmente. Após isso, realizamos a purificação das proteínas pelo método de cromatografia de alta afinidade por metal imobilizado (IMAC) e confirmamos a eluição de ambas proteínas recombinantes por SDS-PAGE e Western Blot.