Elucidação do mecanismo de reação da sonda luminescente AMPPD com a proteína albumina sérica humana

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Barison, Leonardo Almeida [UNESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: AMPPD; Albumina; Fosfatase alcalina; Quimioluminescência; Docking Molecular; Fluorescência; RET; Albumin; Alkaline phosphatase; Chemiluminescence; Molecular docking; Fluorescence
• Link de acesso: https://hdl.handle.net/11449/310177

Compostos quimioluminescentes pertencem a um grupo restrito de moléculas que possuem a capacidade de emitir luz após uma reação química. Neste campo, destacam-se aquelas cujo mecanismo para geração de estados excitados envolvem a clivagem de peróxidos cíclicos conhecidos como dioxetanos. Uma destas moléculas é o 3-(2'espiroadamantil)-4-metoxi-4-(3″-fosforiloxi)-fenil-1,2-dioxetano (AMPPD), que devido a sua estabilidade e disparo controlado de emissão pela enzima fosfatase alcalina (ALP), é utilizado em larga escala em sistemas automatizados em laboratórios clínicos para detecção de hormônio, análise imunológicas entre outras. Em análises deste tipo, o AMPPD poderia entrar em contato com a albumina de soro humano (HSA), que é proteína mais abundante do plasma sanguíneo. Considerando a alta capacidade de ligação da HSA, pode-se esperar sua interação com o AMPPD, o que poderia interferir nas determinações quimioluminescentes que utilizam o AMPPD. Portanto, este trabalho teve por objetivo avaliar e elucidar a interação entre o AMPPD e a proteína HSA e determinar possíveis efeitos na performance de emissão de luz na presença da enzima ALP. Descobriu-se que a emissão de luz do sistema AMPPD/ALP é significativamente afetado pela presença de HSA, tendo sua emissão de luz aumentada em cerca de 100 vezes. Este efeito foi elucidado estudando a eficiência de ligação entre o AMPPD e a HSA que resultou em uma constante de ligação de 1.9x105 M-1. Por meio de marcadores de sítio de ligação, verificou-se que a interação se dá preferencialmente no sítio I da HSA. Estudos de docagem molecular corroboraram este achado. Os estudos indicaram ainda que após hidrólise pela ALP, o AMPPD desfosforilado se difunde para a HSA, onde encontra um microambiente que favorece o aumento do rendimento quântico de emissão de fluorescência da espécie gerada pela clivagem do AMPPD (metil-meta-oxibenzoato), o que explica o efeito da HSA na emissão de luz. Verificou-se também que a albumina de soro bovino (BSA) não tem a mesma eficiência na amplificação da emissão de luz, o que reforça uma interação específica com a HSA. Estudos realizados na presença da sonda fluorescente coumarina-153 evidenciou a transferência de energia de ressonância (RET) do éster excitado metil-meta-oxibenzoato para a coumarina-153. Este achado reforçou as evidências de que ambos estavam complexados a HSA. Em conclusão, estes resultados inéditos sobre o efeito de albumina no sistema AMPPD/ALP poderão ser úteis para a aplicação desse sistema quimioluminescente em análises clínicas e para pesquisadores que trabalham no desenvolvimento de novos sistemas quimioluminescentes.