Caracterização biofísica da interação entre a proteína M2-1 do Vírus Sincicial Respiratório Humano (HRSV) com quercetina

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Teixeira, Thiago Salem Pançonato [UNESP]
• Orientador(a): Souza, Fátima Pereira de [UNESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: HRSV; M2-1; Quercetina; Dinâmica molecular
• Palavras-chave em Inglês: Quercetin; Molecular dynamics
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/137861

O Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) é o principal agente causador de doenças respiratórias agudas severas, como pneumonia e bronquiolite. Trata-se de um vírus da família Paramyxoviridae, com simetria helicoidal e envelope lipídico. Possui um genoma de RNA fita simples, não segmentado, com 10 genes codificantes. Um dos fatores que contribuem para o sucesso na replicação viral é a interação da proteína M2-1 com as proteínas P, M e com o RNA. Tal proteína age através da interação com RNA, e assim, participa efetivamente no processo de replicação viral, apresentando atividade anti-parada da replicação sendo ativa quando na forma tetramérica. Deste modo, o ligante que realizar interação com a M2-1 é um potencial candidato a prevenir as interações M2-1 com RNA e demais proteínas, impedindo deste modo o sucesso da replicação viral. Flovonoides são compostos naturais com várias atividades como antioxidante, anticancerígena, cardio protetora, antibacteriana e antiviral. Quercetina é um flavonoide que apresenta atividade antiviral, inibindo o complexo de replicação. Com a finalidade de investigar a interação de um potencial candidato a inibição da atividade da M2-1, clonamos, expressamos e purificamos a proteína M2-1 do hRSV e, determinamos sua característica físico-química de interação com quercetina em diferentes condições de temperatura. Para clonagem e expressão do gene M2-1 foram escolhidos o vetor pGEX-4T-1 e a bactéria Escherichia coli da linhagem BL21 Gold (DE3). A proteína expressa foi purificada em cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular. As análises de composição de estrutura secundária e estabilidade térmica foram realizadas por espectroscopia de dicroísmo circular e, a interação com Quercetina com espectroscopia de fluorescência. Para o mapeamento da interação com a Quercetina foram realizadas docking molecular e dinâmica molecular. A proteína M2-1 purificada apresenta 40% α-hélice, 10% folhas β e 19% alças e 31% random coils, sendo a temperatura de melting de 55,6°C. O teste de titulação com o flavonoide Quercetina mostrou que ela interage em dois pontos, no sítio 1 (constante de afinidade ~1,5x106 M-1) estabelece uma interação do tipo iônica e no sítio 2 (1,1x105 M-1) estabelece uma interação do tipo hidrofóbica. Uma molécula de Quercetina interage no sítio 1 (formada pelo tetrâmero) e quatro moléculas interagem no sítio 2 (uma por unidade proteica). O estudo de dinâmica molecular mostra que o domínio central (composto de α-hélice) é estável e, a extremidade N-terminal adquire maior estabilidade quando a proteína está na forma tetramérica. O docking do ligante Quercetina mostra que ela pode interagir na face N-terminal com interação do tipo iônica e entre cadeias próxima aos domínios de oligomerização e ligação ao RNA e proteína P, com tipo de interação hidrofóbica. Os dados teóricos reforçam os dados experimentais, mostrando que a quercetina interage com a proteína M2-1, principalmente no poro central da proteína.